农杆菌介导小麦铁蛋白基因转化烟草及抗逆性研究

论文摘要

铁是生命活动过程中所必需的元素,而铁过量会导致氧化性胁迫,对细胞产生毒害,因此维持细胞内铁平衡非常重要。铁蛋白由于具有储铁和释铁的双重功能,是调节生物体内铁代谢平衡的关键蛋白。研究者们已从豌豆、苜蓿、拟南芥等许多植物中克隆出铁蛋白基因。其转基因研究集中在将外源铁蛋白基因导入植物,提高其抗逆性和铁含量。赵永亮等克隆出小麦铁蛋白基因（TaFer）并得到转基因酵母,发现其真核表达产物可有效清除3种活性氧。为深入了解TaFer在转基因应用中的功能,本研究构建烟草表达载体pBI121,通过农杆菌侵染法,将TaFer转入烟草,研究其抗逆性。根据Genebank序列AY864925设计引物,加入酶切位点及His标签。提取小麦总RNA,通过RT-PCR扩增TaFer,命名为Fn。Fn连接pGM-T克隆载体,转化后通过蓝白斑筛选,进行PCR、双酶切鉴定并测序,命名为Fn-pGM-T。 DNAStar软件分析测序结果显示,正确克隆出TaFer,且酶切位点与His标签插入正确。Fn-pGM-T双酶切,pBI121表达载体分步酶切,二者连接后转化,通过PCR和单酶切鉴定,命名为Fn-pBI121.Fn-pBI121转化农杆菌,PCR鉴定结果说明其成功转入农杆菌中。农杆菌活化后侵染烟草叶盘,筛选培养10天有绿色愈伤长出,1月左右将不定芽移至生根培养基,2周开始生根。RT-PCR结果显示TaFer已转入烟草中。GUS染色显示转基因苗中有GUS表达,提粗蛋白进行蛋白质电泳可见目的条带。T1代幼苗进行胁迫（干旱、盐、Cu2+）处理,测定胁迫前、胁迫10天和20天的各种生理生化指标。数据显示：干旱胁迫后转基因烟草的POD酶活、可溶性糖和脯氨酸含量高于野生型。盐胁迫后转基因烟草的可溶性糖含量、POD和CAT酶活高于野生型。Cu2+胁迫后转基因烟草的POD酶活和脯氨酸含量高于野生型。这些结果说明TaFer的转入能够提高烟草抗旱、抗盐和抗Cu2+胁迫的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 铁蛋白
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 主要功能
• 1.1.3 植物铁蛋白基因研究现状
• 1.1.4 小麦铁蛋白基因研究现状
• 1.2 烟草的转基因研究
• 1.2.1 转基因烟草研究现状
• 1.2.2 外源基因的导入技术
• 1.2.3 转基因植株的检测与鉴定
• 1.3 农杆菌侵染法
• 1.3.1 原理
• 1.3.2 农杆菌Ti质粒转化系统优点
• 1.3.3 重组质粒导入农杆菌的方法
• 1.4 植物抗逆性
• 1.4.1 逆境对植物造成的伤害
• 1.4.2 植物与环境胁迫相关的生理生化效应
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.5.1 目的
• 1.5.2 意义
• 第二章 转小麦铁蛋白基因烟草的获得与鉴定
• 2.1 实验材料、试剂和仪器
• 2.1.1 载体、菌种和材料
• 2.1.2 实验主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 小麦铁蛋白基因的克隆
• 2.2.1 小麦总RNA提取
• 2.2.2 cDNA第一链合成
• 2.2.3 PCR
• 2.2.4 扩增片段回收
• 2.2.5 目的片段Fn与克隆载体pGM-T的连接
• 2.2.6 连接产物的大肠杆菌转化
• 2.2.7 重组质粒筛选与检测
• 2.3 烟草表达载体的构建
• 2.3.1 表达载体pBI121的分步双酶切
• 2.3.2 目的基因与表达载体pBI121的连接
• 2.3.3 连接产物大肠杆菌转化
• 2.3.4 重组质粒筛选与检测
• 2.4 烟草表达载体的农杆菌转化
• 2.4.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.2 感受态细胞的转化
• 2.4.3 重组质粒筛选与检测
• 2.5 转化烟草
• 2.5.1 种烟草
• 2.5.2 农杆菌活化
• 2.5.3 转化
• 2.5.4 培养与筛选
• 2.6 转基因烟草T0代检测
• 2.6.1 转录水平检测——RT-PCR
• 2.6.2 GUS组织化学染色
• 2.6.3 Western印迹
• 第三章 转小麦铁蛋白基因烟草T1代抗逆性的初步研究
• 3.1 种烟草
• 3.1.1 处理
• 3.1.2 发芽
• 3.1.3 移栽
• 3.2 干旱胁迫
• 3.2.1 处理
• 3.2.2 叶片相对含水量测定
• 3.2.3 保护酶类活性测定
• 3.2.4 可溶性蛋白质含量测定
• 3.2.5 可溶性糖类含量测定
• 3.2.6 脯氨酸含量测定
• 3.2.7 丙二醛含量测定
• 3.3 盐胁迫
• 3.3.1 处理
• 3.3.2 生理生化指标测定
• 2+胁迫'>3.4 Cu²⁺胁迫
• 3.4.1 处理
• 3.4.2 生理生化指标测定
• 第四章 实验结果与分析
• 4.1 小麦铁蛋白基因的克隆
• 4.1.1 小麦总RNA提取
• 4.1.2 PCR扩增
• 4.1.3 重组质粒提取
• 4.1.4 PCR鉴定
• 4.1.5 双酶切鉴定
• 4.1.6 测序结果
• 4.2 烟草转化载体的构建
• 4.2.1 载体pBI121分步双酶切
• 4.2.2 重组质粒提取
• 4.2.3 PCR鉴定
• 4.2.4 单酶切鉴定
• 4.3 pBI121-Fn重组质粒的农杆菌转化
• 4.3.1 pBI121-Fn重组质粒提取
• 4.3.2 PCR鉴定
• 4.4 转基因烟草筛选和检测
• 4.4.1 转基因烟草的筛选
• 4.4.2 RT-PCR鉴定
• 4.4.3 GUS组织染色
• 4.4.4 Wertern印迹
• 4.5 抗逆性研究结果与分析
• 4.5.1 干旱胁迫结果与分析
• 4.5.2 盐胁迫结果与分析
• 2+胁迫结果与分析'>4.5.3 Cu²⁺胁迫结果与分析
• 第五章 讨论
• 5.1 关于植物组织培养与筛选的讨论
• 5.1.1 筛选培养
• 5.1.2 生根培养
• 5.1.3 移栽
• 5.1.4 Western印迹失败原因分析
• 5.2 关于转TaFer烟草抗逆性研究的讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学习期间的研究成果及发表的学术论文