金属硫蛋白印迹聚合物研究

论文摘要

金属硫蛋白（metallothionein,MT）是一类具有低分子量、高巯基含量,能大量结合重金属离子的活性蛋白质。本文介绍了金属硫蛋白的研究进展,在综述了分子印迹技术（molecular imprintedtechnology,MIT）的基本理论、制备技术及应用研究的基础上,制备了具有分子识别能力的分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer,MIP）,采用静态吸附、特异性吸附、扫描电镜等方法对聚合物进行了表征,同时对印迹聚合物的印迹机理进行了初步探讨。论文的主要研究内容和结论如下:①考察了工业化生产金属硫蛋白粗品的生产工艺,并提出了精品的生产工艺。同时对诱导后家兔肝、肾和肺中金属硫蛋白的含量进行了比较,对诱导次数以及采用生理盐水作为诱导剂进行了研究。②采用沉淀聚合法,以金属硫蛋白为印迹分子、丙烯酸（AA）为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交联剂、偶氮二异丁腈（AIBN）为光引发剂、氯仿为溶剂制备了金属硫蛋白印迹聚合物。考察了丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈的用量以及聚合物粒径大小对聚合物吸附量的影响,同时对聚合物的吸附动力学和解吸率进行了研究。实验结果表明,采用5mg左右的金属硫蛋白作为印迹分子,丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯的最佳比例关系为1∶2（V/V）;聚合物粒径越小,吸附性能就越好;聚合物的吸附平衡时间以及解吸率分别为4h和54.91%。③采用本体聚合法制备了金属硫蛋白的印迹聚合物。研究了本体聚合法合成印迹聚合物的最佳条件,溶液的用量等。结果表明,当丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯的最佳用量比例关系为1∶1（V/V）时,采用光引发制备的金属硫蛋白印迹聚合物具有较好的吸附效果;印迹聚合物对金属硫蛋白具有特异性吸附,吸附量明显高于非印迹分子。④通过紫外光冷引发制备了金属硫蛋白的印迹复合膜（MT-ICMs）,比较了以尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜为支撑体形成的印迹聚合物的吸附性能,重点研究了以尼龙膜为支撑体的金属硫蛋白印迹复合膜的性能。结果显示,该膜表面均匀,韧性较好,对金属硫蛋白具有良好的选择性,且吸附平衡和解吸时间都较短,有利于工业化应用,同时该研究也为其生产应用提供了实验基础。⑤以金属硫蛋白为印迹分子,超薄纳米二氧化钛作为吸附和印迹基质,采用表面溶胶凝胶分子印迹技术制备了新型的分子印迹聚合物,使用石英晶体微天平现场技术研究了金属硫蛋白在超薄纳米二氧化钛印迹膜和非印迹膜表面的吸附行为。通过印迹,金属硫蛋白在纳米二氧化钛表面的吸附量比非印迹膜提高了3倍,吸附平衡常数为47.9L·g-1（金属硫蛋白浓度为0.4mg/mL）。印迹膜对金属硫蛋白具有良好的特异性识别能力,而对非印迹分子的吸附量明显较低。此实验为进一步研究金属硫蛋白的性质及其应用提供了理论依据。⑥通过红外光谱、平衡结合方法、Scatchard分析以及透射电镜（TEM）等手段对金属硫蛋白印迹聚合物的印迹机理进行了初步探讨。采用红外光谱研究了加入金属硫蛋白后功能单体丙烯酸官能团谱峰的变化,结果表明金属硫蛋白分子中的-SH与丙烯酸中的C=O在氯仿溶液中能形成π-π键,由聚合物的吸附特性和Scatchard分析可以得出,金属硫蛋白印迹聚合物至少存在三种结合位点,其高、中、低的最大吸附量分别为3.3896mg/g、0.9362mg/g、1.6583mg/g;通过透射电镜可以观察到,金属硫蛋白在聚合过程中主要以分子两端的巯基作为结合位点,不同位置的巯基受到的空间位阻不同,导致产生了三种不同的结合位点。本文的研究为进一步利用分子印迹技术进行金属硫蛋白的分离纯化、生产工艺的简化提供了一个新的方法,并为其更好的应用提供了实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1.1 金属硫蛋白的理化性质
• 1.1.1 金属硫蛋白的分类
• 1.1.2 金属硫蛋白的结构
• 1.2 金属硫蛋白的主要分离纯化方法
• 1.2.1 层析法
• 1.2.2 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.2.3 毛细管电泳法
• 1.2.4 其它分离方法
• 1.3 金属硫蛋白目前的主要检测方法
• 1.4 分子印迹技术在蛋白质分离纯化中的应用
• 1.4.1 分子印迹技术的起源与发展概况
• 1.4.2 分子印迹技术理论
• 1.4.3 分子印迹聚合物的制备条件
• 1.4.4 分子印迹聚合物的制备方法
• 1.4.5 分子印迹技术和分子印迹聚合物的应用
• 1.5 选题目的、意义及论文的主要研究内容
• 1.5.1 研究的目的和意义
• 1.5.2 研究的主要内容
• 第二章 金属硫蛋白的提取与纯化
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂及仪器
• 2.2.2 金属硫蛋白的生产工艺
• 2.2.3 测定方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 金属硫蛋白粗品的层析曲线
• 2.3.2 诱导后家兔体内不同部位金属硫蛋白含量比较
• 2.3.3 诱导次数对家兔体内金属硫蛋白含量的影响
• 2.3.4 不同体重、不同注射次数对金属硫蛋白含量的影响
• 2.3.5 生理盐水对家兔体内金属硫蛋白含量的影响
• 2.3.6 金属硫蛋白精品脱盐层析曲线
• 2.3.7 金属硫蛋白的质谱和氨基酸组分分析
• 2.3.8 样品实验
• 2.4 本章小结
• 第三章 沉淀聚合法制备金属硫蛋白-MIP及其性能研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂及仪器
• 3.2.2 沉淀聚合法制备金属硫蛋白印迹聚合物
• 3.2.3 聚合物对金属硫蛋白的吸附和解吸研究
• 3.2.4 测定方法
• 3.2.5 特异性吸附研究
• 3.2.6 聚合物表观测试
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 丙烯酸对吸附量的影响
• 3.3.2 乙二醇二甲基丙烯酸酯对吸附量的影响
• 3.3.3 偶氮二异丁腈对吸附量的影响
• 3.3.4 不同粒径聚合物颗粒吸附比较
• 3.3.5 金属硫蛋白印迹聚合物的选择结合性研究
• 3.3.6 静态吸附
• 3.3.7 解吸实验
• 3.3.8 金属硫蛋白印迹聚合物的表观结构
• 3.3.9 其它因素的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 本体聚合法制备金属硫蛋白-MIP及其性能研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂及仪器
• 4.2.2 本体聚合法制备金属硫蛋白印迹聚合物
• 4.2.3 聚合物表观测试
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 聚合条件的选择
• 4.3.2 溶剂的选择
• 4.3.3 溶剂量对聚合物的影响
• 4.3.4 金属硫蛋白印迹聚合物与空白聚合物的吸附比较
• 4.3.5 聚合物的静态吸附
• 4.3.6 解吸实验
• 4.3.7 特异性吸附
• 4.3.8 印迹聚合物的表观结构
• 4.4 本章小结
• 第五章 金属硫蛋白印迹膜的制备及其性能研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂及仪器
• 5.2.2 金属硫蛋白印迹膜的制备
• 5.2.3 无支撑体印迹聚合膜（IPM）吸附比较
• 5.2.4 不同支撑体印迹复合膜的吸附比较
• 5.2.5 尼龙-印迹复合膜（Nylon-ICM）吸附实验
• 5.2.6 尼龙-印迹复合膜（Nylon-ICM）解吸实验
• 5.2.7 尼龙-印迹复合膜（Nylon-ICM）特异性吸附实验
• 5.2.8 尼龙-印迹复合膜（Nylon-ICM）使用次数实验
• 5.2.9 印迹复合膜（Nylon-ICM）的表观测试
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 单体的选择
• 5.3.2 无支撑体膜的吸附比较
• 5.3.3 不同支撑体分子印迹膜比较
• 5.3.4 静态吸附曲线
• 5.3.5 解吸曲线
• 5.3.6 特异性吸附曲线
• 5.3.7 印迹复合膜使用次数
• 5.3.8 印迹复合膜的表面结构
• 5.3.9 分子印迹膜分离过程识别机理
• 5.4 本章小结
• 第六章 表面溶胶-凝胶法印迹金属硫蛋白
• 6.1 纳米二氧化钛概述
• 6.1.1 纳米二氧化钛的结构
• 6.1.2 纳米二氧化钛的性质
• 6.1.3 本研究用到的二氧化钛形貌
• 6.1.4 压电生物传感器
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 实验原理
• 6.2.2 试剂与仪器
• 2膜的制备'>6.2.3 纳米TiO₂膜的制备
• 6.2.4 金属硫蛋白溶液在QCM上的吸附测定
• 6.3 结果与讨论
• 2上的吸附动力学'>6.3.1 金属硫蛋白在纳米TiO₂上的吸附动力学
• 6.3.2 溶液浓度对金属硫蛋白印迹膜吸附量的影响
• 2膜上的吸附'>6.3.3 金属硫蛋白在不同TiO₂膜上的吸附
• 6.3.4 不同pH溶液对金属硫蛋白吸附量的影响
• 2印迹膜的吸附特异性'>6.3.5 纳米TiO₂印迹膜的吸附特异性
• 6.4 本章小结
• 第七章 金属硫蛋白印迹聚合物印迹机理研究
• 7.1 前言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 试剂及仪器
• 7.2.2 金属硫蛋白印迹聚合物的制备
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 印迹聚合物中非均一性结合位点的形成
• 7.3.2 红外分析
• 7.3.3 金属硫蛋白印迹聚合物的吸附特性
• 7.3.4 Scatchard分析
• 7.3.5 TEM分析
• 7.4 本章小结
• 第八章 全文总结与展望
• 8.1 全文总结
• 8.2 本文主要创新点
• 8.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果