转Bt cry8Ea1、cry8Ha1基因花生的研究

论文摘要

花生是重要的油料作物之一,我国是花生生产、消费及出口大国。由于蛴螬独特的生活习性,常规的化学与生物防治手段难以有效防治,对花生的为害逐年加重,严重影响了花生的产量和品质,急需开辟新的防治途径。苏云金芽胞杆菌cry8类基因编码的晶体蛋白对金龟科、叶甲科等多种鞘翅目害虫有特异的杀虫活性。cry8Ea1、cry8Ha1基因是本实验室克隆的、具有自主知识产权的新基因,对金龟科暗黑腮金龟具有很高的特异毒杀作用。因此建立高效的花生遗传转化体系、构建转基因抗虫花生具有重要的理论意义和实用价值。本研究首先建立了发根农杆菌介导的花生遗传转化体系,优化了影响转化效率的各因素,获得含有转cry8类基因根系的嵌合植株,并且快速鉴定转基因根系抗地下害虫能力,利用根癌农杆菌介导的花生遗传转化,获得了转cry8类基因花生植株,主要研究结果如下:花生高效表达载体的构建。克隆了烟草的核基质附着序列（MAR）,插入pCAMBIA2300载体,得到含有顺式重复MAR序列的基础载体pDMAR。从烟草中克隆了根特异性启动子TobRB7,分别将TobRB7启动子和35S启动子插入基础载体pDMAR。同时在合成的cry8Ea1、cry8Ha1基因的上游添加了Ω序列和Kozak序列,下游添加了内质网定位信号（KDEL）,引入优化的载体中,分别得到由根特异性启动子TobRB7及组成型启动子35S驱动的cry8类基因的表达载体,并导入发根农杆菌和根癌农杆菌中。发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立。利用发根农杆菌将含有报告基因gfp及GUS基因的载体pGFPGUSplus导入花生根系中,Southern杂交表明gfp基因整合到花生根系基因组中,RT-PCR及GUS染色的结果显示,gfp基因在转基因根系中能正常转录,GUS基因能表达为有活性的酶,证明通过该体系可以成功的将外源基因导入到花生根系中。探索了花生基因型、发根农杆菌活力及接种量等因素对转化效率的影响,确定最佳的转化条件为接种指数期的发根农杆菌,接种量为每个外植体5×107个细胞,共培养2天,共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度为50μmol l-1,最大转化效率为61%。利用该体系转化花生,从花生播种到获取足量可用于分子鉴定及生测的转化根,需要45天,是一个快速高效的转化体系。转cry8Ea1和cry8Ha1基因花生根系的获得。将由组成型启动子35S驱动cry8Ea1、cry8Ha1基因导入花生白沙1016中,分别有21株和33株嵌合植株RT-PCR鉴定为阳性。移栽成活的植株接种暗黑鳃金龟幼虫,分别有62.5%和66.7%的含转基因根系的嵌合植株危害等级为0级,植株地上部分生长旺盛,地下根系比较发达。生物活性测定的结果表明,经密码子优化的cry8Ea1、cry8Ha1基因在花生中异源表达后对暗黑鳃金龟有较好的杀虫活性。根癌农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立。以幼叶和去胚子叶为外植体,添加NAA、TDZ和6-BA外源激素,最大的芽诱导率分别可以达到40.9%和48.3%。通过根癌农杆菌浸泡叶片和去胚子叶外植体,得到卡那抗性植株。经PCR鉴定,分别有30株和5株cry8Ea1、cry8Ha1基因为阳性。ELISA的结果表明,Cry8Ha1蛋白占叶片可溶性蛋白可达0.24%。本研究建立了快速鉴cry8类基因在花生根系中抗蛴螬能力的体系,并利用根癌农杆菌介导的花生遗传转化得到了转cry8Ea1、cry8Ha1基因的花生植株,为培育抗地下害虫蛴螬的花生新品种奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图和附表
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 地下害虫蛴螬的危害和防治
• 1.1.1 蛴螬的危害
• 1.1.2 蛴螬的防治
• 1.2 苏云金芽胞杆菌cry8 类基因的研究
• 1.2.1 Bt 杀虫晶体蛋白
• 1.2.2 杀虫晶体蛋白作用机理
• 1.2.3 Bt cry8 类基因
• 1.3 抗虫转基因植物的研究及应用
• 1.3.1 抗虫转基因植物概述
• 1.3.2 影响cry 基因在植物体内表达的因素及应对措施
• 1.3.3 转基因植物环境安全性
• 1.4 发根农杆菌的研究与应用
• 1.4.1 发根农杆菌概述
• 1.4.2 发根农杆菌的应用
• 1.5 花生分子育种的研究进展
• 1.5.1 花生再生体系的建立
• 1.5.2 花生遗传转化体系的建立
• 1.6 本研究的立题依据与目的与意义
• 1.6.1 立题依据
• 1.6.2 目的意义
• 1.7 本论文的主要研究内容
• 第二章 cry8Ea1、cry8Ha1 基因植物表达载体的构建
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 基因检测引物
• 2.1.3 培养基与抗生素
• 2.1.4 酶与生化试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基础载体构建流程
• 2.2.2 菌种活化
• 2.2.3 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA
• 2.2.4 PCR 反应
• 2.2.5 酶切分析
• 2.2.6 DNA 片段回收
• 2.2.7 连接体系
• 2.2.8 E. coli 及农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.9 重组质粒的筛选与鉴定
• 2.2.10 SDS 法提取植物基因组
• 2.2.11 根部特异性启动子的克隆
• 2.2.12 核基质附着序列MAR 的克隆
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 根部特异性启动子的克隆
• 2.3.2 核基质附着序列MAR 的克隆及含MAR 序列基础载体的改造
• 2.3.3 cry8 类基因表达元件的优化
• 2.3.4 cry8Ea1、cry8Ha1 基因植物表达载体的构建
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株与质粒
• 3.1.3 抗生素、酶和试剂
• 3.1.4 仪器设备
• 3.1.5 培养基
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 发根农杆菌介导的微量注射方式侵染花生
• 3.2.2 发根农杆菌生长曲线的绘制
• 3.2.3 发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化
• 3.2.4 TRIzol 法提取花生根系总RNA 及反转录
• 3.2.5 GUS 染色
• 3.2.6 Southern 杂交
• 3.2.7 数据分析
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 发根农杆菌介导的微量注射方式侵染花生体系的建立
• 3.3.2 发根农杆菌介导花生遗传转化体系的优化
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 转cry8Ea1、cry8Ha1 花生根系的获得
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基与抗生素
• 4.1.3 检测引物
• 4.1.4 供试昆虫
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 发根农杆菌介导微量注射方式侵染花生
• 4.2.2 TRIzol 法提取花生根系总RNA 及反转录
• 4.2.3 转基因根系生物活性测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 转cry8Ea1 和cry8Ha1 基因根系的RT-PCR 鉴定
• 4.3.2 转cry8Ea1 和cry8Ha1 基因根系的生物活性测定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 花生组织培养体系的建立
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 激素
• 5.1.3 培养基
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 以去胚子叶为外植体芽诱导培养基的确定
• 5.2.2 以去胚子叶为外植体的花生再生体系
• 5.2.3 以幼叶为外植体芽诱导培养基及伸长培养基的确定
• 5.2.4 以幼叶为外植体的花生再生体系
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 以去胚子叶为外植体组织培养体系的建立
• 5.3.2 以幼叶为外植体组织培养体系的建立
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 根癌农杆菌介导的花生遗传转化
• 6.1 材料与试剂
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 激素
• 6.1.3 菌株与质粒
• 6.1.4 检测引物
• 6.1.5 培养基与抗生素
• 6.1.6 酶与生化试剂
• 6.2 研究方法
• 6.2.1 以去胚子叶为外植体遗传转化体系的建立
• 6.2.2 以幼叶为外植体抗生素筛选压的确定
• 6.2.3 以幼叶为外植体遗传转化体系的建立
• 6.2.4 以幼叶为外植体遗传转化体系的优化
• 6.2.5 抗性芽分子鉴定
• 6.2.6 转基因植物的ELISA 检测
• 6.2.7 转基因植株中载体骨架断裂位置的确定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 以去胚子叶为外植体遗传转化体系的建立
• 6.3.2 以幼叶为外植体遗传转化体系的建立
• 6.3.3 影响以幼叶为外植体遗传转化效率的因素
• 6.3.4 转cry8Ha1、cry8Ea1 基因花生的分子检测
• 6.3.5 转cry8Ha1 基因花生的ELISA 检测
• 6.3.6 基础载体pDMAR 骨架断裂位置的确定
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历