论文题目: 提高丹参毛状根生产丹参酮的诱导和过程策略研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化工
作者: 晏琼
导师: 胡宗定,吴建勇
关键词: 丹参毛状根,丹参酮,诱导子,胞外吸附,半连续培养
文献来源: 天津大学
发表年度: 2005
论文摘要: 丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国传统常用的中草药之一。近数十年来随着其新的药理作用的不断发现,对丹参的来源和开发利用又形成了新的研究热点。如何获得有效成分含量高、品质稳定的丹参资源是丹参作为高品质植物药大规模进军国际市场的一个最大障碍。利用毛状根培养技术进行丹参有效成分的生产是具有潜力的方法之一,目前已有一些相关的报道,但是这些研究还不全面和深入。因此本文对提高丹参毛状根中有效成分产量的方法和过程策略进行了研究,并进一步分析了其相关的作用机理。目前在毛状根中已有的研究结果表明诱导也成为了提高毛状根中次生代谢产物产量的有效方法。考虑到诱导的选择性,本文考查了不同种类诱导子对丹参毛状根中有效成分之一的丹参酮合成的诱导效果,从中筛选出了诱导效果较好并且制备方便的生物诱导子Yeast extract （YE）和非生物诱导子Ag+。为了深入了解诱导子诱导丹参酮产量提高的作用机理,本文考查了质膜Ca2+内流对诱导效果的作用。与现在一般认为质膜Ca2+内流在诱导子诱导次生代谢产物产量提高过程中起着重要的作用不同,本文的研究结果表明在丹参毛状根中诱导子诱导丹参酮的合成不完全依赖于质膜Ca2+的内流。对利用毛状根技术生产次生代谢产物的发展而言,开发能够有效提高其次生代谢产物产量的过程策略具有重要的意义。本文根据毛状根自身的半固定特性,在诱导作用和胞外吸附作用的研究基础上,开发了整合多次诱导、胞外吸附和半连续操作模式的过程策略。结果表明这一过程策略的应用能有效提高丹参毛状根生产丹参酮的产量,在培养的第60 d丹参毛状根的干重达到30.5 g/L,丹参酮的总体积产量达到87.5 mg/L（对照组的15倍）,同时树脂对丹参酮的总回收率为76.5%。并且过程中总丹参酮的生产速率达到1.46 mg/L-d,是批次培养过程丹参酮生产速率的7.4倍。为了深入了解过程策略中诱导和胞外吸附技术联合作用的机理,本文建立了联合作用下丹参酮合成和分布的动力学模型。模型较好地反映了实验结果,为过程的进一步放大和研究提供了可靠的预测依据。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
前 言
第一章 文献综述
1.1 毛状根的培养和应用
1.1.1 毛状根培养体系的建立
1.1.2 毛状根的特性
1.1.3 影响毛状根培养和次生代谢产物形成的因素
1.1.4 毛状根培养技术的应用研究进展
1.1.4.1 生产次生代谢产物
1.1.4.2 毛状根培养的放大和生物反应器的研究
1.1.4.3 为新药筛选提供材料
1.1.4.4 获得转基因植株和改良植物品种
1.1.4.5 植物代谢工程研究
1.2 丹参
1.2.1 丹参的主要化学成分
1.2.1.1 二萜类化合物
1.2.1.2 酚酸类化合物
1.2.1.3 其他化合物
1.2.2 丹参的药理作用
1.2.3 临床应用的丹参制剂
1.2.4 丹参的组织培养
1.2.4.1 离体克隆培养增殖丹参试管苗
1.2.4.2 人工诱导丹参多倍体的研究
1.2.4.3 丹参的细胞培养与活性成分的产生
1.2.4.4 转化的丹参组织和器官培养与活性成分的产生
1.3 提高次生代谢产物产量的方法
1.3.1 诱导子技术
1.3.1.1 诱导子的分类和选择
1.3.1.2 诱导子的作用特点
1.3.1.3 诱导子的作用机制
1.3.1.4 诱导子在毛状根培养中的应用
1.3.2 两相培养技术
1.3.2.1 两相培养的分类和第二相的选择原则
1.3.2.2 固－液两相系统在次生代谢产物生产中的应用
1.3.3 半连续培养技术
1.4 本文主要研究内容
第二章 丹参毛状根悬浮培养的基本性质
2.1 实验材料和方法
2.1.1 丹参毛状根的悬浮培养
2.1.2 毛状根湿重和干重的测定
2.1.3 丹参酮的提取和含量测定
2.1.4 可溶性总糖的含量测定
2.1.5 培养液电导率的测定
2.2 结果与讨论
2.2.1 悬浮培养丹参毛状根的形态学特征
2.2.2 丹参毛状根悬浮培养生长、丹参酮合成以及底物消耗的动力学过程
2.2.3 培养过程中生物量与底物消耗的计量关系
2.2.4 丹参毛状根悬浮培养过程中电导率的变化
2.3 小结
附图
第三章 诱导作用对丹参毛状根生长和合成丹参酮的影响
3.1 实验材料和方法
3.1.1 丹参毛状根的悬浮培养
3.1.2 生物诱导子的制备
3.1.3 非生物诱导子的制备
3.1.4 毛状根干重的测定
3.1.5 丹参酮的提取和含量测定
3.1.6 诱导实验方案
3.1.6.1 生物和非生物诱导子的作用效果实验
3.1.6.2 诱导子协同作用实验
3.2 结果与讨论
3.2.1 生物和非生物诱导子的作用效果
3.2.1.1 生物诱导子对丹参毛状根生长和总丹参酮产量的影响
3.2.1.2 非生物诱导子对丹参毛状根生长和总丹参酮产量的影响
3.2.1.3 诱导子对不同丹参酮诱导效果的比较
3.2.1.4 讨论
3.2.2 诱导子的协同作用效果试验
3.2.2.1 诱导子Yeast extract和Ag~+协同作用的效果
3.2.2.2 诱导子Yeast extract和Co~(2+)协同作用的效果
3.2.2.3 诱导子Yeast extract和AIB协同作用的效果
3.2.2.4 讨论
3.3 小结
第四章 质膜 Ca~(2+)内流在诱导子诱导丹参毛状根积累丹参酮过程中的作用研究
4.1 实验材料和方法
4.1.1 丹参毛状根的悬浮培养
4.1.2 毛状根干重的测定
4.1.3 丹参酮的提取和含量测定
4.1.4 诱导子的制备
4.1.5 Ca~(2+)拮抗剂和离子载体的配制
4.1.6 实验方案
4.1.6.1 Ca~(2+)拮抗剂以及离子载体的作用效果实验
4.1.6.2 诱导子诱导丹参酮的生产对外源Ca~(2+)的依赖性实验
4.2 结果与讨论
4.2.1 各种诱导子和Ca~(2+)拮抗剂对丹参酮合成的影响
4.2.2 Ca~(2+)拮抗剂和离子载体对诱导子诱导丹参酮合成的影响
4.2.3 Ca~(2+)离子浓度对诱导子诱导丹参酮合成的影响
4.2.4 诱导子和Ca~(2+)拮抗剂对毛状根生长的影响
4.2.5 讨论
4.3 小结
第五章 胞外吸附、诱导子作用和半连续培养对丹参酮生产和回收的协同作用研究
5.1 实验材料和方法
5.1.1 丹参毛状根的悬浮培养
5.1.2 毛状根干重的测定
5.1.3 丹参酮的提取和含量测定
5.1.4 诱导子的制备
5.1.5 吸附剂的准备
5.1.6 实验方案
5.1.6.1 树脂X-5对丹参酮的吸附实验研究
5.1.6.2 胞外吸附、诱导子作用和培养液更新实验
5.2 结果与讨论
5.2.1 树脂X-5对丹参毛状根生长、丹参酮合成和释放的影响
5.2.2 树脂X-5吸附丹参酮以及丹参酮在两相中分布的研究
5.2.3 诱导作用和树脂胞外吸附的联合作用效果
5.2.4 诱导作用、胞外吸附作用和培养液更新组合多次处理的效果
5.2.5 讨论
5.3 小结
附图
第六章 诱导和吸附作用下丹参酮合成和分布的动力学模型
6.1 实验材料和方法
6.1.1 丹参毛状根的悬浮培养
6.1.2 毛状根干重的测定
6.1.3 诱导子的制备
6.1.4 吸附剂的准备
6.1.5 DXS酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase)活力的测定
6.1.6 丹参酮的提取和含量测定
6.1.7 动力学实验
6.2 模型的建立
6.3 计算方法简介
6.4 模型参数求解
6.5 模型模拟
6.5.1 不同培养条件下丹参酮合成和分布的模拟
6.5.2 调整模型参数对丹参酮合成和分布的模拟
6.6 参数敏感度分析
6.7 小结
本章符号表
第七章 诱导子诱导丹参毛状根中迷迭香酸的积累和相关酶活的变化
7.1 实验材料和方法
7.1.1 丹参毛状根的悬浮培养
7.1.2 毛状根干重的测定
7.1.3 诱导子的制备
7.1.4 RA 的提取和含量测定
7.1.5 总酚的提取和含量测定
7.1.6 酶活的测定
7.2 结果与讨论
7.2.1 诱导子对RA和总酚积累的影响
7.2.2 诱导子对PAL和TAT酶活力的影响
7.2.3 诱导子作用下RA和总酚含量变化的动力学过程
7.2.4 诱导子作用下PAL和TAT酶活变化的动力学过程
7.2.5 讨论
7.3 小结
第八章 总结与展望
8.1 总结
8.2 今后研究工作的设想
参考文献
攻读博士学位期间发表的论文
附录
致谢
发布时间: 2007-07-10
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