论文摘要
研究背景及目的结核病（tuberculosis,TB）是一种由结核杆菌（Mycobacteriatuberculosis,MTB）引起的可累及全身多个脏器的人兽共患的慢性传染病,近些年来由于MTB耐药菌株出现、艾滋病合并MTB感染以及高危人群的大规模流动,造成TB的在全球流行,使其成为我国乃至全世界危害最严重的疾病之一。长期以来,化疗一直是防治TB的主要措施,但因化疗的疗程较长、费用较高、毒副作用较大及不规律用药造成耐药株的产生,导致治愈率降低和复发率升高,迫切需要研究更有效的防治措施。而目前广泛用于预防TB的唯一疫苗—BCG,存在许多缺陷,因此开发安全有效的新疫苗势在必行。Esat-6和Mpt64均为MTB早期培养滤液中的一种分泌蛋白有较强的细胞免疫活性,而在大多数BCG中又缺乏其编码基因,因此二者均是基因疫苗的候选目的基因。目前众多研究者所关注的phoP基因与结核杆菌的毒力有密切的关系的[25,26],其对应结核杆菌基因组的Rv0757[53]且其编码转录因子被命名为phoPR二元系统（TCS）。研究证明,phoPR是结核杆菌中重要的毒力调控基因[31],本研究采用λ-Red同源重组系统成功构建了phoP基因缺陷型重组菌、Esat-6基因重组菌和Mpt64基因重组菌各一株,旨在寻求具有较强免疫原性且较弱毒性的结核杆菌突变株,为开发新型结核疫苗奠定基础。材料与方法1、菌株、质粒来源。标准菌株H37Rv由本实验室保存。质粒pKD4、pKD46由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所韩延平博士惠赠。2、菌株培养。采用固体改良罗氏培养基（L-J）和液体苏通培养（sauton）相结合的方法培养。3、线性DNA片段的准备。以H37Rv为模板PCR扩增Esat-6和Mpt64,以pKD4为模板PCR扩增启动目的基因表达的上游片段Kan-p和敲除phoP基因的卡那霉素抗性基因片段phoP-K,用融合PCR方法将Kan-p分别与Esat-6和Mpt64连接组成Kan-Esat-6和Kan-Mpt64融合基因片段。4、电转化。设置电转化参数:2.5KV,25uF,200Ω;取对数生长期的H37Rv菌株制感受态细胞,将质粒pKD46导入H37Rv菌体中,筛选阳性菌株26℃培养至对数生长期,加入L-阿拉伯糖至终浓度为10mmol/L诱导48小时,制感受态细胞,将Kan-Esat-6、Kan-Mpt64、phoP-K导入含有pKD46质粒的H37Rv菌体中,Esat-6和Mpt64基因重组菌株在26℃用普通平板筛选,而phoP基因缺陷型重组菌在26℃用含卡那霉素培养基筛选。5、鉴定。取平板上菌落,煮沸法提取DNA,用引物Homo-arm-F和Homo-arm-R扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳鉴定,切胶测序鉴定。结果齐-尼氏抗酸染色镜检证实用固体改良罗氏培养基（L-J）和液体苏通（sauton）培养基培养的H37Rv菌株生长良好。琼脂糖凝胶电泳证实了PCR扩增出Kan-Esat-6、Kan-Mpt64融合基因和敲除phoP基因的卡那霉素抗性基因片段phoP-K,大小分别为852bp、1248bp、1678bp。取含50ug/ml氨苄青霉素的L-J培养基平板筛选的阳性菌株经PCR鉴定分析,证实质粒pKD46导入成功。将含50ug/ml卡那霉素的L-J培养基平板筛选的阳性菌株和普通平板上筛选的单克隆菌株经PCR鉴定分析,大小风别为1716bp、890bp、1286bp,序列分析与预期结果一致,确证了phoP基因缺陷型重组菌、Esat-6基因重组菌和Mpt64基因重组菌构建成功。结论通过融合PCR成功扩增出Kan-Esat-6、Kan-Mpt64融合基因。构建了phoP基因缺陷型重组菌、Esat-6基因重组菌和Mpt64基因重组菌各一株。