棉纤维发育相关的细胞壁蛋白基因克隆及其表达调控和亚细胞定位分析

论文摘要

棉花纤维是由胚珠部分表皮细胞分化形成的高度伸长不分支的单细胞表皮毛,它不仅是世界上重要的纺织原料,也是一个研究细胞伸长、细胞壁发生和纤维素合成的独特的实验系统。棉花纤维的发育可分为4个连续的发育阶段:（1）纤维起始;（2）细胞伸长;（3）次生细胞壁的沉积;（4）脱水成熟。本研究以我国重要的经济作物棉花作为实验材料,分离和克隆了4个在棉花纤维中特异表达的细胞壁蛋白基因,并对它们的表达调控、细胞亚定位进行了研究。研究结果如下:1.利用Macroarray的方法,分离和鉴定了12个棉花纤维发育相关的细胞壁蛋白基因,其中包括4个extensins、7个PRPs和1个GRP。Real time RT-PCR结果显示3个GhPRPs在纤维中特异表达。我们选取其中2个GhPRP3和GhPRP5做进一步的研究,序列分析表明GhPRP3cDNA包含333 bp的开放阅读框,编码一个111个氨基酸的蛋白质。GhPRP5 cDNA包含546 bp的开放阅读框,编码一个182个氨基酸的蛋白质。这两个基因编码的蛋白之间同源性较低,而且,BlastP分析发现GhPRP3、GhPRP5与其它植物PRP的同源性都很低,含有新的结构单元,推测是新类型的PRPs。Real time RT-PCR和Northern blotting分析表明,这两个基因均在棉花纤维中特异表达并受棉花纤维发育阶段的调控。2.利用本实验室已克隆的FLA cDNA序列以及棉花公共EST库资源,分离鉴定了19个棉花FLAs基因。这些基因编码的蛋白质具有以下特点:N-端具有信号肽序列,含有1-3个AGP结构域和1-2个类成束蛋白结构域。其中的15个GhFLA蛋白在其C-端含有糖基磷脂酰肌醇锚定位点。根据这些特点和它们间的系统进化关系,可以把它们分为四个亚类。Real-timequantitative RT-PCR分析表明,GhFLA基因在棉花不同组织中差异表达。其中,3个基因（GhFLA1/2/4）在10DPA纤维中特异或者优势表达,4个基因（GhFLA6/14/15/18）在10DPA纤维中表达量较高。GhFLA5,GhFLA8和GhFLA9在叶片中表达最高,而其它FLA基因在棉花下胚轴中优势表达。研究结果还表明,在棉纤维中高效或者特异表达的7个基因,其表达也受纤维发育阶段的调节。应用离体胚珠培养技术,研究这几个基因在多种植物激素和NaCl胁迫下表达模式,结果显示FLAs基因的表达受到植物激素和NaCl的调节。上述结果显示一些GhFLAs与棉纤维发育相关,而且受植物激素以及和盐胁迫调节。3.采用Genome walker PCR方法,分离了GhPRP3、GhPRP5、GhFLA1和GhFLA4基因的启动子序列,命名为pGhPRP3、pGhPRP5、pGhFLA1和pGhFLA4。用Plantcare分别对这四个启动子的顺式作用元件进行预测,发现每个启动子中都含有很多真核生物顺式元件的同源序列,如与光应答有关的元件、与激素响应相关的元件、与非生物胁迫应答相关的元件等等。构建了启动子::GUS融合表达载体,并通过农杆菌介导的方法转化烟草和拟南芥,获得一批转基因植株。组织化学分析表明,在pGhFLA1启动子的驱动下,GUS基因在茎维管组织、叶脉和叶柄以及烟草种子表皮中表达,且GUS信号的强度与种子的发育相关;另外,也观察到GUS在部分转基因植株叶柄的表皮毛中表达。pGhFLA4启动子在拟南芥茎、荚果中具有表达活性,且在伤诱导下其表达活性加强。此外,其它两个基因的启动子::GUS融合载体已经导入烟草和拟南芥,获得转基因植株,有关分析正在进行中。4.利用eGFP报告基因,构建基因与eGFP的融合表达载体,研究了GhFLA1和GhFLA4的亚细胞定位。将GhFLA1::GFP和GhFLA4::GFP导入棉花,获得转化愈伤组织。利用激光共聚焦显微技术,观察该融合蛋白的细胞亚定位情况,结果表明,这两个蛋白均定位在细胞膜外膜上。5.利用RNAi技术和过量表达来研究GhFLA1和GhPRP3基因的功能。构建了这两个基因的过量表达载体和RNAi载体,通过农杆菌介导植物转化法,转化棉花和烟草,得到12个GhPRP3过量表达的转基因烟草株系和14个GhFLA1的转基因烟草株系。另外,获得5个过量表达GhFLA1基因的转基因棉花株系,有关RNAi技术转化棉花的工作也在进行中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 高等植物细胞壁的研究进展
• 1.1.1 高等植物细胞壁成分和结构模型
• 1.1.1.1 纤维素
• 1.1.1.2 半纤维素
• 1.1.1.3 果胶
• 1.1.1.4 木质素
• 1.1.1.5 细胞壁蛋白
• 1.1.2 细胞壁结构模型
• 1.1.3 细胞壁的功能
• 1.2 高等植物细胞壁中的结构蛋白质
• 1.2.1 伸展蛋白
• 1.2.1.1 伸展蛋白的结构
• 1.2.1.2 伸展蛋白的结构功能
• 1.2.1.3 伸展蛋白基因的表达及其调节
• 1.2.1.4 伸展蛋白的功能
• 1.2.2 富含甘氨酸蛋白
• 1.2.2.1 细胞壁GRP的结构
• 1.2.2.2 GRP基因的表达及其调控
• 1.2.2.3 GRP功能
• 1.2.3 富含脯氨酸蛋白
• 1.2.3.1 PRP的分类和结构
• 1.2.3.2 PRP基因的表达及其调控
• 1.2.3.3 PRP的功能
• 1.2.4 阿拉伯半乳聚糖蛋白
• 1.2.4.1 AGP的结构
• 1.2.4.2 AGP的表达及其调控
• 1.2.4.3 AGP的功能
• 1.3 立题依据和研究意义
• 第二章 棉花纤维特异表达PRP基因的分离、鉴定和表达分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 菌种和质粒
• 2.2.3 化学试剂和溶液
• 2.2.3.1 常用储存液
• 2.2.3.2 常用缓冲液
• 2.2.3.3 常用培养基
• 2.2.3.4 棉花总RNA的提取试剂
• 2.2.3.5 PCR扩增分析试剂
• 2.2.3.6 转膜和点杂交所用试剂
• 2.2.3.7 Northern杂交用试剂
• 2.2.3.8 实验器材
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 点杂交
• 2.3.1.1 目的cDNA序列的获得
• 2.3.1.2 目的克隆转化E.coli
• 2.3.1.3 碱裂解法提取质粒
• 2.3.1.4 PCR扩增目的片段
• 2.3.2 细胞壁结构蛋白的cDNA芯片杂交
• 2.3.2.1 改良热酚法提取棉花纤维和种皮RNA
• 2.3.2.2 DNase消化除去RNA中的DNA
• 2.3.2.3 RNA的纯化
• 2.3.2.4 纯化RNA的逆转录和探针的标记
• 2.3.2.5 芯片杂交
• 2.3.3 基因序列分析
• 2.3.4 实时定量RT-PCR分析
• 2.3.4.1 逆转录
• 2.3.4.2 PCR检测反应
• 2.3.4.3 引物设计
• 2.3.4.4 Real-time PCR反应
• 2.3.5 Northern杂交
• 2.3.5.1 改良热酚法提取总RNA见方案2.3.2.1
• 2.3.5.2 转膜
• 2.3.5.3 杂交
• 2.3.6 GhPRP3过量表达载体和RNAi载体的植物遗传转化
• 2.3.6.1 引物设计和载体构建
• 2.3.6.2 农杆菌介导的烟草叶盘和棉花下胚轴遗传转化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 芯片杂交分离细胞壁结构蛋白基因
• 2.4.2 GhGRPs序列分析、基因鉴定和表达分析
• 2.4.2.1 棉花GhGRP基因及其编码的蛋白质序列特征
• 2.4.2.2 棉花GhGRP1、GhGRP2和GhGRP3蛋白二级结构特点
• 2.4.2.3 棉花GhGRP1、GhGRP2和GhGRP3基因的组织差异表达
• 2.4.3 GhPRPs序列分析、基因鉴定和表达分析
• 2.4.3.1 棉花GhPRP基因及其编码的蛋白质序列特征
• 2.4.3.2 GhPRP 3-8和GhPRPL结构分析
• 2.4.3.3 典型PRPs的结构特点
• 2.4.3.4 PRPL的结构特点
• 2.4.3.5 GhPRP基因在不同棉花组织中的差异表达
• 2.4.3.6 GhPRP3、GhPRP5和GhPRP7基因表达受棉纤维发育调节
• 2.4.3.7 Northern杂交分析GhPRP基因的表达
• 2.4.4 GhPRP3过量表达和RNAi载体的植物遗传转化
• 2.4.4.1 载体构建及农杆菌转化
• 2.4.4.2 过量表达载体转基因烟草植株的获得及其检测
• 2.5 讨论
• 2.5.1 采用芯片杂交法分离筛选基因
• 2.5.2 用不同基因表达方法验证芯片杂交法分离基因的可靠性
• 2.5.3 棉花GhGRP基因的结构特点和初步表达分析
• 2.5.4 棉花中几个PRP基因的分离鉴定和表达分析
• 2.5.5 GhPRP3过量表达载体烟草遗传转化
• 第三章 棉花FLA基因的分离、鉴定和表达分析
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 激素和NaCl处理离体棉花10DPA胚珠和纤维
• 3.3.2 GhFLA基因的分离
• 3.3.3 GhFLA的鉴定
• 3.3.4 实时定量RT-PCR分析
• 3.3.5 GhFLA1过量表达载体和RNAi载体的植物遗传转化
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 棉花FLA基因的分离
• 3.4.2 棉花FLAs的结构分析
• 3.4.3 GhFLA基因在棉花不同组织中的分化表达
• 3.4.4 GhFLA基因在棉花纤维中的表达是发育调控的
• 3.4.5 GhFLA基因的在纤维中的表达也受植物激素和NaCl的调节
• 3.4.6 GhFLA1过量表达载体和RNAi载体的烟草的遗传转化
• 3.4.7 GhFLA1过量表达载体和RNAi载体的棉花遗传转化
• 3.5 讨论
• 第四章 棉花细胞壁结构蛋白基因启动子的克隆和表达活性分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 菌株和载体
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 培养基
• 4.3 方法
• 4.3.1 引物设计
• 4.3.2 Genome walker PCR方法调取启动子
• 4.3.2.1 利用BD Genome Walker库进行PCR扩增
• 4.3.2.3 启动子片段的测序
• 4.3.2.4 序列分析
• 4.3.3 启动子表达载体的构建和植物遗传转化
• 4.3.3.1 启动子表达载体的构建
• 4.3.3.2 烟草的培养和遗传转化和GUS染色
• 4.3.3.3 拟南芥的培养、遗传转化和GUS染色
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 GhPRP3、GhPRP5、GhFLA1和GhFLA4启动子的获得
• 4.4.2 pGhPRP3、pGhPRP5、pGhFLA1和pGhFLA4序列分析
• 4.4.3 四个启动子序列与GUS融合载体构建
• 4.4.4 启动子载体转化烟草植株及组织化学染色
• 4.4.5 启动子载体转化拟南芥及组织化学染色
• 4.5 讨论
• 4.5.1 启动子分离
• 4.5.2 启动子的生物信息学分析
• 4.5.3 启动子的特异性表达
• 第五章 GhFLA1和GhFLA4蛋白的亚田胞定位
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 植物材料
• 5.2.2 菌株和载体
• 5.2.3 主要试剂
• 5.2.4 主要培养基配方
• 5.3 方法
• 5.3.1 载体构建
• 5.3.1.1 引物设计
• 5.3.1.2 PCR、重组反应以及重组片段的检测
• 5.3.2 农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化
• 5.3.3 愈伤组织细胞的荧光观察和照相
• 5.3.4 拟南芥的培养、遗传转化
• 5.3.5 拟南芥根细胞的荧光观察和照相
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 载体构建及检测
• 5.4.2 GhFLA1和GhFLA4在棉花细胞中的定位
• 5.4.3 GhFLA4在拟南芥根中的定位
• 5.5 讨论
• 参考文献
• 附录
• 博士期间已发表的论文
• 致谢