NMDA受体激活在急性肺损伤CCTα表达下调中的作用及机制

论文摘要

第一章MK801对小鼠油酸型肺损伤的保护作用研究背景急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是临床常见危重疾病,发病机制尚未完全阐明。肺内中性粒细胞、巨噬细胞的滞留和激活在ARDS的发生发展中起重要作用。中性粒细胞、巨噬细胞可释放谷氨酸。Said等人发现谷氨酸离子型受体特异性激动剂N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）可引起离体灌流肺发生高通透性肺水肿。近年来本室的研究还发现NMDA受体阻断剂MK-801对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和高氧等引起的肺损伤具有明显的保护作用,这些研究进一步提示内源性谷氨酸（Glutamate,Glu）的大量释放过度激活NMDA受体参与急性肺损伤的发生发展过程。但为证明内源性Glu的大量释放过度激活NMDA受体在急性肺损伤的发生中具有普遍意义,尚有待在不同模型上进一步证实。方法（1）建立小鼠急性油酸肺损伤模型;（2）测量肺湿重和干重的比值（W/D）并观察肺组织病理变化,以反映肺组织的损伤程度;（3）测定支气管肺泡灌洗液中蛋白和白细胞含量,以反映支气管肺泡毛细血管通透性变化;（4）生化测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）,反映氧化损伤时的肺炎性改变;（5）RT-PCR和免疫组化分别检测CTP:磷酸胆碱二胞苷酰基转移酶α（CTP:phosphocholinecytidylyltransferase alpha,CCTα）mRNA和蛋白水平,反映CCTα转录合成的变化。结果油酸（0.1 ml/kg）尾静脉注射4 h可引起肺组织肺指数、肺湿干重比W/D增加、肺组织MPO活性增加,支气管肺泡灌洗液中蛋白和白细胞含量明显增加,并引起肺组织CCTαmRNA和蛋白水平的明显减低,病理切片示水肿、炎症渗出明显。NMDA受体的阻断剂MK-801（0.1mg/kg,ip）预处理30 min可减轻油酸引起的上述变化。结论油酸引起明显以炎性渗出为主的急性肺损伤,肺内NMDA受体的激活参与油酸急性肺损伤的发生,并引起CCTα表达的下调。第二章NMDA抑制CCTα表达的转录调控机制研究背景CTP:磷酸胆碱二胞苷酰基转移酶（CTP:phosphocholinecytidylyltransferase alpha,CCTα）是磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）合成中的关键调控酶。CCTα基因近端启动子区包含多个与细胞生长、分化密切相关的转录因子Sp1（specificity protein 1）结合位点。探讨Sp1在CCTα启动转录中的作用具有一定的意义。在急性肺损伤（acute lung iniury,ALI）及ARDS等肺部损伤疾病中,肺表面活性物质（pulmonary surfactant,PS）系统功能的异常并参与肺损伤的发生过程。本室前期研究证明一定剂量NMDA作用后,肺Ⅱ型上皮细胞合成CCT mRNA水平、CCTα蛋白表达水平均下降。本研究旨在观察NMDA受体激活后Sp1的改变,探讨NMDA抑制CCTα表达的分子机制。方法（1）萤光素酶报告基因活性检测CCTα启动子活性;（2）荧光定量PCR定量检测Sp1表达质粒后CCTαmRNA;（3）Western blot检测A549细胞转染Sp1表达质粒后CCTα蛋白含量表达水平;（4）Western blot检测A549细胞经NMDA处理后Sp1蛋白含量表达水平;（5）荧光定量PCR定量检测A549细胞经NMDA处理后Sp1mRNA水平;（6）EMSA检测CCTα启动子上Sp1的DNA结合活性及NMDA处理对其影响。结果转染Sp1真核表达质粒30 h后,A549细胞CCTα核心启动子报告基因相对萤光素酶活性增加,A549细胞CCTαm RNA表达水平表达水平增高。转染Sp1真核表达质粒36 h后,CCTα蛋白表达水平表达水平增高。A549细胞经NMDA处理8 h后,Sp1蛋白表达明显下降,并呈时间、剂量依赖。Sp1 mRNA水平没有明显的改变。EMSA检测显示,NMDA处理后A549细胞的核蛋白中转录因子Sp1与DNA的结合活性下调。结论转录因子Sp1促进A549细胞CCTα的启动子活性,增加CCTα的合成表达。NMDA通过下调核内Sp1蛋白与DNA结合活性而抑制CCTα的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 前言
• 第一章 MK801对小鼠油酸型肺损伤的保护作用
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 1.5 附图
• 第二章 NMDA抑制CCTα表达的转录调控机制研究
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果