金鱼雌核发育及其性别分化相关基因的表达

论文摘要

人工雌核发育是一种高效的性别控制育种方式，结合性反转技术可以使获得的后代为全雌鱼苗。本研究利用金鱼（Carassius auratus）进行了人工雌核发育的初探，旨在掌握金鱼雌核发育过程中的关键技术，之后用甲基睾酮浸浴使其性逆转。同时分析Cyp19a、Dmrt2a、Dmrt2b基因在金鱼中的表达情况，并克隆获得Cyp19a基因全长和Dmrt2a的cDNA全长，为从分子水平上调控金鱼性别分化提供理论基础。论文包括以下三部分内容：1.本文以Hank’s液稀释健康五花金鱼精液，紫外线照射方式进行精子灭活处理，紫外线强度为30mJ/cm2，照射时间为3min。取健康红珍珠金鱼300余粒卵子人工受精。之后采用冷应激的方法对染色体加倍处理，处理条件为0℃冷应激45min。试验过程中设置了一个单倍体对照组，即精子经过相同强度和时间的紫外处理，但之后不经过冷应激。孵化过程中观察雌核发育二倍体金鱼胚胎和仔鱼的发育，与正常金鱼无异，而单倍体对照组个体出现了单倍体综合症。将雌核发育二倍体胚胎进行细胞培养，然后分析核型，确定其染色体数目为2n=100。最后孵出仔鱼49条，根据验证结果，初步确定试验中所使用的紫外照射和冷应激条件是合适的。2.通过3’ RACE PCR方法扩增获得Cyp19a基因的3非编码区序列，获得cDNA全长1,557bp。之后通过梯度PCR得到Cyp19a基因内含子序列；采用基因组步移法的获得5’端调控区序列，拼接得到Cyp19a基因DNA全长共6,905bp，包括9个外显子和8个内含子（GenBank登录号No. FJ601913.1）。在金鱼Cyp19a基因2000bp的5’端序列内，位于该序列-48bp处存在一个TATA框，位于-76bp处存在一个CAAT框，在线软件预测金鱼Cyp19a基因5’端区域存在一些保守的调控因子，如甾类生成因子1基因（SF1）识别位点，雌激素受体（ER），SOX-5，SOX-17，叉头框（FORKHEAD）等转录因子结合位点。为了验证金鱼Cyp19a基因5’端调控区启动子活性，将Cyp19a基因5’端调控区插入到启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1中，之后将重组的载体转染到293T细胞中进行瞬时表达，在荧光倒置显微镜下可以检测到绿色荧光信号，表明克隆得到的金鱼Cyp19a基因5’端调控区具有启动子活性。荧光定量分析显示，Cyp19a主要在卵巢中表达，在脑中的表达量较低，卵巢中的表达量是脑中的5倍，而在其他的组织中表达量更低。比较不同发育时期的相对表达量，Cyp19a在仔鱼孵化后的表达量一直很低，在孵化后26天得时候表达量显著升高，而在经过甲基睾酮浸浴处理的26天龄的仔鱼体内Cyp19a没有显著升高。免疫组化结果显示，Cyp19a存在于成鱼卵巢结缔组织的间质细胞中，以及孵化后48天龄的仔鱼卵巢中。成鱼的精巢和低于48天龄的仔鱼中没有免疫阳性反应。3.采用荧光定量PCR技术检测了Dmrt2基因的两个亚型Dmrt2a和Dmrt2b在金鱼不同发育时期以及不同组织中的表达情况，用RACE技术克隆得到金鱼Dmrt2acDNA序列的全长为1755bp，5’和3’非编码区长分别为188bp和67bp，推测的开放阅读框可编码499个氨基酸的多肽。分子系统进化分析表明金鱼Dmrt2a与其它鱼类Dmrt2a基因聚成一支，与斑马鱼（Danio rerio）、红鳍东方鲀（Takifugurubripes）、青鳉（Oryzias latipes）、罗非鱼（Oreochromis Niloticus）Dmrt2a的同源性分别为85%、61%、58%、58%。荧光定量PCR结果揭示，Dmrt2a在精巢中表达量最高，在卵巢中次之，而Dmrt2b在卵巢中表达量最高，在精巢中次之，二者在肾脏、消化道、肝脏、心脏和脑中都有表达，但表达量低；不同发育时期胚胎和仔鱼的Dmrt2a和Dmrt2b表达量差异很大，Dmrt2a在受精后24h达到最高值，之后表达量降低，而Dmrt2b在孵化后仔鱼中表达量显著增加。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1、金鱼简介
• 2、雌核发育
• 2.1 雌核发育的原理
• 2.2 雌核发育的方法
• 3、鱼类性别决定和性别分化
• 3.1 鱼类性别决定的遗传因素
• 3.2 环境因子与性别分化
• 3.3 外源性激素
• 4、芳香化酶
• 5、DMRT 基因
• 6、研究目的和意义
• 第一章 金鱼雌核发育及鉴定
• 1 材料
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 实验仪器
• 2 方法
• 2.1 实验鱼的处理
• 2.2 精子的处理和观察
• 2.3 金鱼精子灭活与染色体加倍
• 2.4 金鱼胚胎细胞培养
• 2.5 染色体制片
• 2.6 胚胎发育过程观察
• 3 结果
• 3.1 精子的处理和观察结果
• 3.2 单倍体对照组形态学结果
• 3.3 雌核发育金鱼胚胎及仔鱼发育过程
• 3.4 雌核发育金鱼胚胎细胞核型分析
• 4 讨论
• 第二章 金鱼 Cyp19a 基因分子特征和表达分析
• 1 材料
• 1.1 实验用鱼
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 2 方法
• 2.1 RNA 的提取与鉴定
• 2.2 金鱼基因组 DNA 提取
• 2.3 金鱼 Cyp19a 基因全长克隆
• 2.4 金鱼 Cyp19a 基因启动子序列和功能分析
• 2.5 实时荧光定量 PCR
• 2.6 石蜡切片制作及 HE 染色
• 2.7 免疫组化
• 3 结果
• 3.1 基因全长克隆
• 3.2 Cyp19a 基因启动子活性检测
• 3.3 Cyp19a 基因表达量分析
• 3.4 Cyp19a 免疫组织化学定位
• 4 讨论
• 第三章 金鱼 Dmrt2 基因表达分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 金鱼 Dmrt2a 基因全长的扩增
• 2.2 Dmrt2a 基因序列分析
• 2.3 实时荧光定量 PCR
• 3 结果
• 3.1 Dmrt2a 基因全长的扩增及结构分析
• 3.2 Dmrt2a 和 Dmrt2b 序列比对及进化树构建
• 3.3 Dmrt2a 和 Dmrt2b 表达量分析
• 4 讨论
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢