miR-15a对流感病毒诱导细胞凋亡机制研究

论文摘要

目的：以流感病毒感染的人肺腺癌上皮细胞模型为研究对象,用Real-timePCR技术、反义及过表达技术、生物信息学分析等技术鉴定出目的miRNA与流感病毒感染的关联机制,分析目的miRNA在流感病毒感染致病进程中的作用机制。方法：应用Real-time PCR技术检测流感病毒感染后宿主细胞miR-15a的表达情况；通过反义及过表达技术影响宿主细胞内miR-15a的表达,然后从细胞形态观察、活细胞计量、病毒增殖情况、流式细胞技术检测细胞凋亡等角度初探miR-15 a与流感病毒感染致病的关联机制做进一步验证；以先验相关研究结果为基础,鉴定已知的miR-15a的靶基因的表达情况,同时使用生物信息学方法鉴定潜在的miR-15a新的靶基因,进一步深入阐明其在流感病毒感染致病过程中的作用机制。结果：本实验成功构建了miR-15a真核表达载体,PCR鉴定及DNA序列测定均与目的基因序列一致。Real-time PCR检测结果显示miR-15a表达量明显高于阴性对照质粒组的表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）；Real-time PCR检测结果显示,A549细胞转染流感病毒后,miR-15a表达显著上调,差异具有统计学意义（P<0.05）；通过过表达和抑制miR-15a后,应用CCK-8法检测显示随着miR-15a inhibitor剂量的减少,细胞病变率随之增加,说明miR-15a能够诱导细胞凋亡；流式细胞仪-Annexin V/PI双染色法检测显示随着miR-15a inhibitor剂量的增加,细胞病变率也随之减少,结果说明miR-15a参与了流感病毒诱导的A549细胞凋亡；miR-15a靶基因在mRNA和蛋白水平的表达结果均显示三个靶基因BCL2、CCND1和P85的表达均随病毒感染进程Oh、12h、24h逐渐下调；Action无肉眼可见差异。说明流感病毒通过感染细胞,影响miR-15a表达上调,进而下调BCL2、CCND1和P85这三个靶基因,从而诱导细胞凋亡；生物信息学方法分析miR-15a潜在的其它靶基因。应用TargetScanTargetScan 5.1 （http://www.targetscan.org/）与PicTar （http://pictar.mdc-berlin.de/）两种计算方法预测miR-15a的靶基因,将其结果的交集进行生物通路富集分析和Biocarta通路数据库富集分析等,为进一步探求miR-15a其它的靶基因提供些许思路。结论：以上研究显示miR-15a参与了流感病毒诱导细胞凋亡的生物进程,随着我们研究的不断深入,将进一步了解miR-15a对流感病毒的作用机制,为流感病毒的预防和治疗提供帮助。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言（绪论）
• 1 流感病毒概况
• 1.1 流感病毒的发病机理
• 2 microRNA与病毒
• 2.1 microRNA的特点
• 2.2 miRNA的作用机制
• 2.3 病毒和宿主在miRNA层次上的互作
• 2.3.1 病毒编码的miRNA调节病毒和宿主基因表达
• 2.3.2 细胞miRNA在病毒感染过程中发挥重要作用
• 2.3.3 病毒通过宿主miRNA来调控其靶基因的表达
• 2.4 miR-15a
• 3 结语与展望
• 第一章 流感病毒感染A549细胞后miR-15a表达变化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 药品与试剂
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养及转染
• 1.2.2 Real-time PCR检测miR-15a在A549细胞中的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 提取的总RNA鉴定
• 2.2 Real-time PCR检测流感病毒感染后miR-15a的表达情况
• 3 讨论
• 第二章 miR-15a真核表达载体的构建及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 药品与试剂
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 寡聚单链DNA的设计和退火
• 1.2.2 双链DNA的装载及测序
• 1.2.3 细胞培养及转染
• 1.2.4 Real-time PCR检测miR-15a表达载体在A549细胞中的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的PCR鉴定及DNA序列测定
• 2.2 miR-15a表达质粒在A549细胞中的表达
• 3 讨论
• 第三章 miR-15a参与流感病毒诱导的细胞凋亡
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 药品与试剂
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 CCK-8法检测表达抑制miR-15a表达后流感病毒所致细胞病变
• 1.2.2 流式细胞仪-Annexin Ⅴ/PI双染色法检测细胞凋亡率
• 1.2.3 miR-15a靶基因的表达
• 1.2.4 统计学处理
• 2 结果与分析
• 2.1 CCK-8法检测表达miR-15a后流感病毒所致细胞病变率
• 2.2 流式细胞仪-Annexin Ⅴ/PI双染色法检测细胞凋亡率
• 2.2.1 流式细胞术观察转染对细胞凋亡的影响
• 2.3 miR-15a靶基因的表达
• 2.3.1 流感病毒感染后miR-15a靶基因在mRNA水平的表达
• 2.3.2 流感病毒感染后miR-15a靶基因在蛋白水平的表达
• 3 讨论
• 第四章 生物信息学方法分析潜在的其它靶基因
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 miR-15a预测靶基因的获得
• 2.2 miR-15a预测靶基因的GO注释描述及GO分类富集分析
• 2.3 miR-15a预测靶基因的生物通路富集分析
• 3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 符号表
• 致谢
• 个人简历