本文主要研究内容
作者宋成创（2019）在《IGF2基因来源的IGF2 AS和miR-483调控牛骨骼肌细胞增殖分化机制研究》一文中研究指出：骨骼肌是畜禽肉类食品的重要组成部分,其肌纤维类型组成是影响肉品质的重要因素。因此,研究骨骼肌发育对于如何提高肉产量以及改善肉品质具有一定的指导意义。至今,有关骨骼肌形成过程的研究已有大量的报道。骨骼肌发育始于胚胎期,由中胚层的体节迁移出Pax3+/Pax7+肌源性祖细胞,由生肌调节因子Myf5、MyoD以及MRF4参与调控的成肌定向分化,肌细胞进一步经过增殖、分化融合形成肌纤维;在出生后,肌纤维数目基本确定,肌肉量的增加主要依赖肌纤维的增长和增粗。当骨骼肌受到损伤刺激或者运动时,骨骼肌具备再生修复能力,而这种能力主要依靠肌源性干细胞（卫星细胞,Pax7+/Myf5-）的激活,激活后的卫星细胞（Pax7+/Myf5+）可以向成肌进行分化,融合形成新的肌纤维,达到修复受伤肌纤维的目的。无论是胚胎阶段的骨骼肌形成,还是出生后骨骼肌的生长甚至损伤后的再生修复过程,除受到Pax3/Pax7,MRFs的调控外,还受到MEF2家族成员,Wnt等信号分子,IGFs等生长因子以及非编码RNA的调控。近年来,有关非编码RNA调控骨骼肌的发育的研究备受关注,其重要性不容忽视。本论文的研究重点在于运用高通量测序技术筛选秦川牛不同发育阶段（胚胎期、出生期以及成年阶段）骨骼肌差异表达的非编码RNA（lncRNAs和miRNAs）,通过5’RACE和3’RACE、RT-qPCR、FISH、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、RNA pull down、流式细胞术等技术,系统阐释源于生长因子IGF2基因内含子区域的非编码RNA IGF2 AS和miR-483在牛骨骼肌发育中的功能和分子机制。主要研究结果如下:1、肌肉组织中lncRNAs的筛选、鉴定及表达特征分析本研究在实验室前期秦川牛不同发育阶段（胚胎期、出生后和成年阶段）骨骼肌lncRNA高通量测序的基础之上,进一步对已筛选的401个差异表达的lncRNA进行挖掘鉴定分析。发现在生长因子IGF2基因内含子区域存在一个反义转录本,将其命名为IGF2 antisense transcript（IGF2 AS）。通过cDNA末端快速扩增（RACE）,发现此转录本由698个核苷酸的单外显子组成。经蛋白编码潜能软件CPC预测分析发现,IGF2AS的编码能力较弱,属于非编码RNA。高通量测序结果和RT-qPCR验证结果都证实,IGF2 AS主要在胚胎阶段的骨骼肌中表达。在牛骨骼肌细胞生长阶段,IGF2 AS表达量相对较高;在分化时期,IGF2 AS的表达呈现出上升的趋势。2、IGF2 AS调控牛骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的功能研究运用RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、EdU、CCK8、RNA-seq、细胞免疫荧光等试验揭示IGF2 AS在牛骨骼肌发育过程中的功能。在牛骨骼肌细胞增殖阶段,干扰IGF2 AS表达抑制细胞增殖关键基因的表达水平,导致G1期细胞数目增加,S期细胞减少,细胞增殖活性下降,而过表达IGF2 AS后结果与之相反;在牛骨骼肌细胞分化阶段,干扰IGF2 AS抑制生肌调控因子的表达水平,MyHC阳性肌管的数目减少,而过表达IGF2 AS后结果与之相反;另外,干扰IGF2 AS导致牛骨骼肌细胞生长阶段凋亡细胞数目的增加,而过表达IGF2 AS抑制牛骨骼肌细胞的凋亡。3、IGF2 AS调控牛骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的机制研究RNA核质分离和荧光原位杂交实验结果表明,IGF2 AS在牛骨骼肌细胞的细胞质和细胞核中都表达。经DNaseⅠ和RNase A处理细胞总RNA后,PCR检测结果表明IGF2AS与IGF2 mRNA的前体序列可形成互补双链结构。放线菌素D处理生长阶段的牛骨骼肌细胞发现,IGF2 AS的表达能够稳定IGF2不同转录本的表达。RIP分析结果表明,Ago-2蛋白质可与IGF2 AS结合,推测IGF2 AS具有竞争性内源RNA的潜质。双荧光素酶报告分析结果表明,miR-221/miR-222与IGF2 AS存在竞争性结合关系,进一步的功能验证结果表明过表达IGF2 AS能够恢复miR-221/miR-222靶基因MyoD的表达。RNA pull down、蛋白质谱以及RIP检测结果表明,蛋白质ILF3可与IGF2 AS结合。IGF2AS正调控ILF3的表达,干扰ILF3后抑制牛骨骼肌细胞增殖和分化,促进牛骨骼肌细胞凋亡。4、miR-483通过IGF1/PI3K/Akt信号通路调控牛骨骼肌细胞增殖和分化MicroRNA高通量测序分析结果表明,位于IGF2基因内含子区域的miR-483在不同发育阶段的骨骼肌中差异表达,且在胚胎期表达量较高。功能研究结果表明,过表达miR-483抑制牛骨骼肌细胞的增殖和分化,干扰miR-483促进牛骨骼肌细胞的增殖和分化。机制研究表明,IGF1是miR-483的一个靶基因,并且miR-483可以通过下调IGF1的表达,影响PI3K/Akt信号通路关键蛋白的表达。本研究借助高通量测序技术筛选差异表达的lncRNA和microRNA,阐明lncRNA和microRNA在牛骨骼肌发育过程中的功能和作用机制,为研究非编码RNA调控牛骨骼肌发育提供理论基础。
Abstract
gu ge ji shi chu qin rou lei shi pin de chong yao zu cheng bu fen ,ji ji qian wei lei xing zu cheng shi ying xiang rou pin zhi de chong yao yin su 。yin ci ,yan jiu gu ge ji fa yo dui yu ru he di gao rou chan liang yi ji gai shan rou pin zhi ju you yi ding de zhi dao yi yi 。zhi jin ,you guan gu ge ji xing cheng guo cheng de yan jiu yi you da liang de bao dao 。gu ge ji fa yo shi yu pei tai ji ,you zhong pei ceng de ti jie qian yi chu Pax3+/Pax7+ji yuan xing zu xi bao ,you sheng ji diao jie yin zi Myf5、MyoDyi ji MRF4can yu diao kong de cheng ji ding xiang fen hua ,ji xi bao jin yi bu jing guo zeng shi 、fen hua rong ge xing cheng ji qian wei ;zai chu sheng hou ,ji qian wei shu mu ji ben que ding ,ji rou liang de zeng jia zhu yao yi lai ji qian wei de zeng chang he zeng cu 。dang gu ge ji shou dao sun shang ci ji huo zhe yun dong shi ,gu ge ji ju bei zai sheng xiu fu neng li ,er zhe chong neng li zhu yao yi kao ji yuan xing gan xi bao （wei xing xi bao ,Pax7+/Myf5-）de ji huo ,ji huo hou de wei xing xi bao （Pax7+/Myf5+）ke yi xiang cheng ji jin hang fen hua ,rong ge xing cheng xin de ji qian wei ,da dao xiu fu shou shang ji qian wei de mu de 。mo lun shi pei tai jie duan de gu ge ji xing cheng ,hai shi chu sheng hou gu ge ji de sheng chang shen zhi sun shang hou de zai sheng xiu fu guo cheng ,chu shou dao Pax3/Pax7,MRFsde diao kong wai ,hai shou dao MEF2jia zu cheng yuan ,Wntdeng xin hao fen zi ,IGFsdeng sheng chang yin zi yi ji fei bian ma RNAde diao kong 。jin nian lai ,you guan fei bian ma RNAdiao kong gu ge ji de fa yo de yan jiu bei shou guan zhu ,ji chong yao xing bu rong hu shi 。ben lun wen de yan jiu chong dian zai yu yun yong gao tong liang ce xu ji shu shai shua qin chuan niu bu tong fa yo jie duan （pei tai ji 、chu sheng ji yi ji cheng nian jie duan ）gu ge ji cha yi biao da de fei bian ma RNA（lncRNAshe miRNAs）,tong guo 5’RACEhe 3’RACE、RT-qPCR、FISH、RNAjie ge dan bai mian yi chen dian （RIP）、RNA pull down、liu shi xi bao shu deng ji shu ,ji tong chan shi yuan yu sheng chang yin zi IGF2ji yin nei han zi ou yu de fei bian ma RNA IGF2 AShe miR-483zai niu gu ge ji fa yo zhong de gong neng he fen zi ji zhi 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :1、ji rou zu zhi zhong lncRNAsde shai shua 、jian ding ji biao da te zheng fen xi ben yan jiu zai shi yan shi qian ji qin chuan niu bu tong fa yo jie duan （pei tai ji 、chu sheng hou he cheng nian jie duan ）gu ge ji lncRNAgao tong liang ce xu de ji chu zhi shang ,jin yi bu dui yi shai shua de 401ge cha yi biao da de lncRNAjin hang wa jue jian ding fen xi 。fa xian zai sheng chang yin zi IGF2ji yin nei han zi ou yu cun zai yi ge fan yi zhuai lu ben ,jiang ji ming ming wei IGF2 antisense transcript（IGF2 AS）。tong guo cDNAmo duan kuai su kuo zeng （RACE）,fa xian ci zhuai lu ben you 698ge he gan suan de chan wai xian zi zu cheng 。jing dan bai bian ma qian neng ruan jian CPCyu ce fen xi fa xian ,IGF2ASde bian ma neng li jiao ruo ,shu yu fei bian ma RNA。gao tong liang ce xu jie guo he RT-qPCRyan zheng jie guo dou zheng shi ,IGF2 ASzhu yao zai pei tai jie duan de gu ge ji zhong biao da 。zai niu gu ge ji xi bao sheng chang jie duan ,IGF2 ASbiao da liang xiang dui jiao gao ;zai fen hua shi ji ,IGF2 ASde biao da cheng xian chu shang sheng de qu shi 。2、IGF2 ASdiao kong niu gu ge ji xi bao zeng shi 、fen hua he diao wang de gong neng yan jiu yun yong RT-qPCR、Western blot、liu shi xi bao shu 、EdU、CCK8、RNA-seq、xi bao mian yi ying guang deng shi yan jie shi IGF2 ASzai niu gu ge ji fa yo guo cheng zhong de gong neng 。zai niu gu ge ji xi bao zeng shi jie duan ,gan rao IGF2 ASbiao da yi zhi xi bao zeng shi guan jian ji yin de biao da shui ping ,dao zhi G1ji xi bao shu mu zeng jia ,Sji xi bao jian shao ,xi bao zeng shi huo xing xia jiang ,er guo biao da IGF2 AShou jie guo yu zhi xiang fan ;zai niu gu ge ji xi bao fen hua jie duan ,gan rao IGF2 ASyi zhi sheng ji diao kong yin zi de biao da shui ping ,MyHCyang xing ji guan de shu mu jian shao ,er guo biao da IGF2 AShou jie guo yu zhi xiang fan ;ling wai ,gan rao IGF2 ASdao zhi niu gu ge ji xi bao sheng chang jie duan diao wang xi bao shu mu de zeng jia ,er guo biao da IGF2 ASyi zhi niu gu ge ji xi bao de diao wang 。3、IGF2 ASdiao kong niu gu ge ji xi bao zeng shi 、fen hua he diao wang de ji zhi yan jiu RNAhe zhi fen li he ying guang yuan wei za jiao shi yan jie guo biao ming ,IGF2 ASzai niu gu ge ji xi bao de xi bao zhi he xi bao he zhong dou biao da 。jing DNaseⅠhe RNase Achu li xi bao zong RNAhou ,PCRjian ce jie guo biao ming IGF2ASyu IGF2 mRNAde qian ti xu lie ke xing cheng hu bu shuang lian jie gou 。fang xian jun su Dchu li sheng chang jie duan de niu gu ge ji xi bao fa xian ,IGF2 ASde biao da neng gou wen ding IGF2bu tong zhuai lu ben de biao da 。RIPfen xi jie guo biao ming ,Ago-2dan bai zhi ke yu IGF2 ASjie ge ,tui ce IGF2 ASju you jing zheng xing nei yuan RNAde qian zhi 。shuang ying guang su mei bao gao fen xi jie guo biao ming ,miR-221/miR-222yu IGF2 AScun zai jing zheng xing jie ge guan ji ,jin yi bu de gong neng yan zheng jie guo biao ming guo biao da IGF2 ASneng gou hui fu miR-221/miR-222ba ji yin MyoDde biao da 。RNA pull down、dan bai zhi pu yi ji RIPjian ce jie guo biao ming ,dan bai zhi ILF3ke yu IGF2 ASjie ge 。IGF2ASzheng diao kong ILF3de biao da ,gan rao ILF3hou yi zhi niu gu ge ji xi bao zeng shi he fen hua ,cu jin niu gu ge ji xi bao diao wang 。4、miR-483tong guo IGF1/PI3K/Aktxin hao tong lu diao kong niu gu ge ji xi bao zeng shi he fen hua MicroRNAgao tong liang ce xu fen xi jie guo biao ming ,wei yu IGF2ji yin nei han zi ou yu de miR-483zai bu tong fa yo jie duan de gu ge ji zhong cha yi biao da ,ju zai pei tai ji biao da liang jiao gao 。gong neng yan jiu jie guo biao ming ,guo biao da miR-483yi zhi niu gu ge ji xi bao de zeng shi he fen hua ,gan rao miR-483cu jin niu gu ge ji xi bao de zeng shi he fen hua 。ji zhi yan jiu biao ming ,IGF1shi miR-483de yi ge ba ji yin ,bing ju miR-483ke yi tong guo xia diao IGF1de biao da ,ying xiang PI3K/Aktxin hao tong lu guan jian dan bai de biao da 。ben yan jiu jie zhu gao tong liang ce xu ji shu shai shua cha yi biao da de lncRNAhe microRNA,chan ming lncRNAhe microRNAzai niu gu ge ji fa yo guo cheng zhong de gong neng he zuo yong ji zhi ,wei yan jiu fei bian ma RNAdiao kong niu gu ge ji fa yo di gong li lun ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的宋成创，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于高通量测序论文,肌细胞增殖论文,肌细胞分化论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。