金属硫蛋白在原核生物中的表达及在环境治理中的应用

论文摘要

金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸的低分子量，金属结合蛋白。广泛存在于从细菌到哺乳动物的多种生物体内。金属硫蛋白与重金属解毒有关，并且参与真核生物体内许多微量金属元素的代谢。金属硫蛋白的主要特征之一是富含半胱氨酸，约占氨基酸总数的1／3，但是蛋白质结构中并没有二硫键。金属硫蛋白的特殊结构及其重要的生理作用，引起许多科学家的研究兴趣。据报道，在已知各种金属硫蛋白中，人类的金属硫蛋白的解毒能力最强，并且能安全的应用于药物，食品，化妆品中。这篇论文选取人肝金属硫蛋白-ⅠA进行研究。在大肠杆菌中表达人类金属硫蛋白，并研究蛋白质的性质和应用。与其它真核生物的基因相比较，金属硫蛋白在大肠杆菌中表达量很低，目前仍然不知道其原因。传统的金属硫蛋白的生产是从经过重金属诱导的哺乳动物的肝脏中提取的，这种方法成本昂贵并且产量很低。在本研究中，通过用原核生物大肠杆菌工程菌表达金属硫蛋白，从而降低其生产成本，并且研究了工程菌在生物吸附中的作用。本文采用化学法合成人肝金属硫蛋白ⅠA的基因。首先根据Genbank中报道的人肝金属硫蛋白ⅠA的氨基酸序列，并根据大肠杆菌对密码子的偏好性设计结构基因序列，然后根据载体上的多克隆位点在合成基因的两端设计酶切位点，C端为SalⅠ和EcoRⅠ，N端为BamHⅠ。为了便于后续实验中的蛋白质分析纯化，在C端添加了含六个组氨酸的His-tag。由于金属硫蛋白容易被原核生物中的蛋白水解酶分解，所以经常将金属硫蛋白以融合蛋白的形式表达以增加它的稳定性同时还要确保蛋白的结构和功能不受融合蛋白标签的影响。经常与谷胱甘肽转移酶或者β-半乳糖苷酶融合表达。本实验中选用pGEX-4T-1作为表达载体，通过酶切连接将合成基因插入到表达载体中，构建金属硫蛋白表达质粒pGHM，将其转入到大肠杆菌BL21和JM109中。实验结果经过琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质印迹分析检测，证实在构建的工程菌株中有金属硫蛋白的表达。通过对所构建的工程菌对砷的吸附量，吸附时间的检测及pH值，诱导物，砷浓度等条件的影响，结果表明，表达MT的工程菌与对照相比吸附砷的能力明显增加，每克干菌体对砷的吸附量由76.3μg提高到319.6μg，提高了3倍以上，并且在1h内达到了最大吸附量的70％以上。本实验成功了构建的能够高效异源表达人肝金属硫蛋白的工程菌株，为后续的金属硫蛋白的性质及生产研究奠定了基础。并且研究了工程菌株在环境治理中的应用。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 绪论
• 1.1 金属硫蛋白的研究进展
• 1.1.1 金属硫蛋白的理化特征
• 1.1.2 金属硫蛋白的结构
• 1.1.3 金属硫蛋白与金属的结合
• 1.1.4 MT的合成
• 1.1.5 金属硫蛋白的基因结构与调控表达
• 1.1.6 金属硫蛋白的功能
• 1.2.砷的代谢和毒性机理
• 1.2.1 对砷及其代谢产物的吸附研究
• 1.2.2 砷的毒理
• 1.3 砷的污染情况
• 1.4 含砷废水处理技术方法
• 1.4.1 化学法处理含砷废水
• 1.4.2 物化法处理含砷废水
• 1.4.3 微生物法处理含砷废水
• 第二章 高效表达金属硫蛋白质粒载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 培养基和培养条件
• 2.2.4 DNA操作技术
• 2.2.5 菌种保藏
• 2.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.7 蛋白表达量分析
• 2.2.8 蛋白质印迹分析（Western Blot Analysis）
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 人肝金属硫蛋白基因的化学合成
• 2.3.2 蛋白表达质粒pGHM的构建
• 2.3.3 金属硫蛋白表达质粒pEHM的构建
• 2.3.4 SDS-PAGE检测金属硫蛋白的表达
• 2.3.5 蛋白表达量的分析
• 2.3.6 Western Blot Analysis进一步检测表达的蛋白
• 第三章 表达金属硫蛋白的基因工程改造的大肠杆菌增强吸附能力研究
• 3.1 引言
• 3.2 方法与材料
• 3.2.1 培养基
• 3.2.2 抗生素的使用浓度
• 3.2.3 工程菌吸附重金属的预处理
• 3.2.4 工程菌吸附重金属的测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 金属硫蛋白工程菌对重金砷的吸附作用
• 3.3.2 砷的浓度对E.coli（pGHM）砷吸附的影响
• 3.3.3 IPTG对E.coli（pGHM）吸附砷的影响
• 3.3.4 E.coli（pGHM）吸附砷的时间效应
• 3.3.5 pH对E.coli（pGHM）吸附砷的影响
• 3.3.6 不同重金属离子对E.coli（pGHM）吸附砷的影响
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表