羟基红花黄色素A抗谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用

论文摘要

一、研究背景谷氨酸（Glutamic acid,Glu）是中枢神经系统的一种兴奋性神经递质,在中枢神经系统中起重要作用。病理情况下谷氨酸大量释放产生的神经毒性是导致神经细胞损伤和多种神经退行性疾病的重要因素。羟基红花黄色素A（hydroxysaffloryellow A,HSYA）是红花花瓣中的一种水溶性色素单体,主要生理作用是抗氧化,目前已有的文献主要集中在其对动物脑缺血导致的神经损伤保护作用的初步研究,但从细胞和分子水平研究HSYA的抗氧化作用报道甚少,尤其是在体外抗谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用研究未见报道。二、研究目的探讨HSYA体外抗谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用及其机制,为研究抗谷氨酸氧化性神经损伤药物及临床神经退行性疾病的防治提供实验依据。三、研究方法以体外原代培养的Wistar胎鼠（E14～15d）大脑皮层神经元为实验材料,体外培养24h后,进行分组实验。1、免疫细胞化学法（MAP2）对体外培养48小时的神经元进行纯度鉴定;2、倒置相差显微镜下形态观察,采集各组细胞的形态照片;3、吖啶橙染色观察各组细胞形态变化;4、MTT法分析HSYA抗谷氨酸氧化性神经毒性的作用浓度;5、Ho33342和PI荧光双染法检测各实验组细胞坏死与凋亡情况;6、分光光度法测定各实验组细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量及超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）活力水平;7、流式细胞术分析细胞凋亡率;8、激光扫描共聚焦显微镜分析各实验组细胞内游离Ca2+浓度变化;9、Western-blot法检测不同实验组细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平及活性caspase-3、caspase-9含量变化;四、实验结果1、MAP2鉴定神经元的纯度:体外培养48小时的神经细胞纯度达到90%以上;2、形态学观察:原代培养48h的神经元分散均匀,胞体呈三角形或多边形,饱满立体感强,部分细胞伸出较短的突起,少数细胞之间建立突起联系;Glu作用12h,大部分细胞缩成圆形,突起消失,胞体立体感差,可见较多凋亡细胞;HSYA保护组细胞生长状态良好,细胞间仍保持良好的突起联系,少见细胞皱缩破碎现象。3、吖啶橙荧光染色:正常组细胞核呈圆形或椭圆形,显示黄绿色荧光,细胞质显示橘红色荧光;Glu损伤组较多细胞核出现染色质固缩、边集和核碎片,部分细胞周围有黄绿色或橘红色的凋亡小体出现;而HSYA保护组（160μg/ml）正常细胞数量明显增加,少见凋亡和坏死细胞。4、MTT法分析:与Glu损伤组（细胞相对存活率36.31%）相比,HSYA保护组可维持较高的细胞相对存活率,在0.4～160μg/ml范围内,对Glu氧化性神经毒性的保护效果随HSYA作用浓度的增高而逐渐增强,最佳保护浓度为160μg/ml,细胞相对存活率达89.49%。5、Ho33342和PI荧光双染,正常组细胞核圆形或椭圆形,显示蓝色荧光;Glu损伤组呈蓝色荧光的部分细胞核出现固缩、新月形边集或被分割成多个不规则小体,荧光强度增强,约30%细胞核显示红色荧光;HSYA保护组（160μg/mL）绝大部分细胞核呈蓝色荧光,形状规则,仅见少量红色荧光细胞。6、分光光度法检测:（1）细胞内GSH含量:正常组116.3394mg/L,Glu损伤组47.6664 mg/L,HSYA保护组94.3452mg/L,提示HSYA（160μg/ml）可维持GSH于较高水平而不被耗竭。（2）细胞内SOD活力:正常组46.9966U/mgprot,Glu损伤组20.697 U/mgprot,HSYA保护组39.4981U/mgprot,提示HSYA（160μg/ml）可显著增强SOD的活力。7、流式细胞术分析:正常组细胞凋亡率为0.43%、Glu损伤组为20.56%、HSYA保护组为7.94%,提示HSYA（160μg/ml）可显著抑制Glu引起的细胞凋亡。8、细胞内游离Ca2+浓度分析:正常组荧光强度为10.147、Glu损伤组64.059、HSYA保护组23.344,提示HSYA可以显著抑制Glu引起的细胞内游离的Ca2+释放。9、Western-blot检测结果:将Western-blot检测结果图采用NIH系统Image J图像分析软件分析蛋白相对表达量,结果显示:（1）Bcl-2:与正常组（151.18）相比,Glu损伤组细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平明显降低（7.8）,HSYA（160μg/ml）能够维持较高的Bcl-2表达量（119.38）。（2）Bax:与正常组（78.05）相比,Glu损伤组细胞中促凋亡蛋白Bax表达水平明显升高（122.88）,HSYA（160μg/ml）能够在一定程度上抑制Bax的表达（102.19）。（3）活性caspase-3:正常组相对含量为50.37,Glu损伤组为132.4,HSYA（160μg/ml）保护组为91.96,提示Glu能够诱导活性caspase-3含量显著升高;而HSYA能够通过抑制caspase-3的活性含量对Glu氧化性神经损伤起保护作用。（4）活性caspase-9:正常组相对含量为34.28,Glu损伤组为187.07,HSYA（160μg/ml）保护组为80.34,提示Glu能够诱导活性caspase-9含量显著升高;而HSYA能够通过抑制caspase-9的活性含量对Glu氧化性神经损伤起保护作用。五、实验结论1、HSYA在体外对谷氨酸诱导的氧化性神经毒性具有保护作用,最佳保护浓度为160μg/ml;2、谷氨酸的氧化性神经毒性以细胞内GSH的耗竭为主要特征,HSYA可维持细胞中GSH含量及SOD活力于较高水平,从而对谷氨酸氧化性神经毒性起保护作用;3、HSYA能够显著抑制谷氨酸引起的细胞凋亡;4、HSYA通过降低细胞内游离Ca2+释放、影响凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达水平及活化caspase-3和caspase-9的含量,而影响到其下游信号的传递和凋亡事件的发生;5、首次分析确定了HSYA抗谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用,为研究抗氧化性神经毒性的药物及临床治疗神经退行性疾病提供实验依据;

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 论文正文
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 实验结论
• 附图表
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表