甜橙（Citrus sinensis Osbeck）红肉突变体类胡萝卜素合成相关基因的克隆与特性分析

论文摘要

柑橘红肉突变体果实富含多种对人体有益的类胡萝卜素。这些突变体不仅能为研究柑橘芽变形成，而且还对研究柑橘果实类胡萝卜素代谢提供素材。本研究以甜橙红肉突变体红肉脐橙（C．sinensis Osbeck）和红色暗柳橙（C．sinensis Osbeck）为实验材料，分析了其果实发育过程中类胡萝卜素变化趋势和相关基因的表达；并构建了红肉脐橙果肉cDNA文库，开发了部分EST。主要研究结果如下： 1、完善了柑橘成熟果肉的RNA提取方法。发现在RNA提取过程中，先用无水乙醇去除果肉中的水分，能获得高纯度和高浓度的RNA样品。 2、对红肉脐橙和华盛顿脐橙8-11月份的果实类胡萝卜素总量和组分变化进行了分析。结果表明：红肉脐橙果实中类胡萝卜素总量、番茄红素和八氢番茄红素比华盛顿脐橙高。红肉脐橙果肉中β-胡萝卜素含量要高于华盛顿脐橙，但后者果皮α-胡萝卜素含量比红肉脐橙高。 3、克隆并分析了红肉脐橙与华盛顿脐橙果实发育过程中类胡萝卜素合成途径9个相关基因。结果表明： 1) 红肉脐橙和华盛顿脐橙番茄红素β环化酶基因（Lcyb）均为单拷贝等位基因，有2个不同的转录本，这2个转录本之间有差异，但品种间没有差异。mRNA原位杂交和RT-PCR分析表明，Lcyb表达量随果实成熟上升，但在红肉脐橙白皮层中没有表达或表达量很低。 2) 红肉脐橙和华盛顿脐橙八氢番茄红素合成酶基因（Psy）均为2个拷贝，两者推导的氨基酸只有1个残基的差异。其表达量随着果实成熟而上升，但红肉脐橙白皮层中Psy基因的表达量要比华盛顿脐橙高。 3) 红肉脐橙和华盛顿脐橙番茄红素ε环化酶基因（Lcye）为单拷贝基因。在果实发育过程中均发生了选择性剪接，形成两个转录本，其中一个转录本缺失14bp产生终止突变。包含缺失区的DNA含有2个6bp的正向重复。 4) 牻儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因（Ggps）、β-胡萝卜素羟化酶基因（Bch）等另外6个基因在红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中均有表达，但番茄红素上游基因表达量要比下游基因高。对这6个基因的拷贝数分析表明，红肉脐橙和华盛顿脐橙没有差异。 4、采用cDNA-AFLP研究了红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中差异表达基因。通过120对引物组合扩增，获得了1个在红肉脐橙果肉中增强表达的片断，并

论文目录

• 摘要
• Abastract
• 缩略词表
• 第一章 问题提出与研究进展
• 1.1 课题的提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 芽变的概念及其在果树育种中的地位
• 1.2.1.1 芽变的概念
• 1.2.1.2 芽变的特点
• 1.2.1.3 芽变的细胞学和遗传学基础
• 1.2.1.3.1 芽变的细胞学基础
• 1.2.1.3.2 芽变的遗传学基础
• 1.2.2 柑橘体细胞突变（芽变）及其在品种改良中的作用
• 1.2.2.1 芽变与柑橘品种改良
• 1.2.2.2 柑橘芽变的主要类型和色泽突变
• 1.2.3 果树芽变的分子机理研究进展
• 1.2.3.1 反转录转座子插入
• 1.2.3.2 DNA甲基化状态的改变
• 1.2.3.3 基因结构和表达差异
• 1.2.4 柑橘红肉突变体的研究
• 1.2.4.1 柑橘红肉突变体中的主要呈色色素
• 1.2.4.2 柑橘红肉突变体的变异原因
• 1.2.5 高等植物类胡萝卜素合成相关基因的研究进展
• 1.2.5.1 高等植物类胡萝卜素的生物合成途径
• 1.2.5.2 高等植物类胡萝卜素生物合成途径中主要酶及其基因的研究进展
• 1.2.5.3 高等植物类胡萝卜素生物合成与调控
• 1.2.5.3.1 转录调控
• 1.2.5.3.2 转录后调控
• 1.2.5.3.3 调节基因的调控
• 1.2.5.3.4 其他因素的影响
• 1.2.6 植物基因克隆方法研究进展
• 1.2.6.1 同源序列法
• 1.2.6.2 表达序列标签
• 1.2.6.3 cDNA-AFLP技术
• 1.3 本研究的目的和内容
• 第二章 甜橙红肉突变体果实发育过程中类胡萝卜素的变化趋势及相关基因的克隆与分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中类胡萝卜素含量分析
• 2.2.2 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中Lcyb的克隆与分析
• 2.2.2.1 总RNA的提取及mRNA分离
• 2.2.2.2 cDNA合成
• 2.2.2.3 引物的合成、PCR扩增、电泳
• 2.2.2.4 PCR扩增产物的克隆与测序
• 2.2.2.5 Lcyb的拷贝数分析
• 2.2.2.6 Lcyb在果实不同组织中的PCR-RFLP分析
• 2.2.2.7 Lcyb在柑橘果实发育过程中表达模式的RT-PCR分析
• 2.2.2.8 Lcyb的mRNA原位杂交分析
• 2.2.2.9 序列分析
• 2.2.3 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中Psy的克隆与分析
• 2.2.4 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中Lcye的克隆与分析
• 2.2.5 红肉脐橙和华盛顿脐橙中其他类胡萝卜素合成相关基因的克隆与分析
• 2.2.6 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中的cDNA-AFLP分析
• 2.2.6.1 反转录
• 2.2.6.2 cDNA-AFLP分析
• 2.2.6.3 差异表达片段的分离和RT-PCR模式分析
• 2.2.6.4 RACE获得差异表达基因全长
• 2.2.7 红肉脐橙等12个柑橘品种中的copia-like反转录转座子的研究
• 2.2.7.1 实验材料
• 2.2.7.2 引物合成及PCR扩增
• 2.2.7.3 Southern杂交
• 2.2.7.4 RT-PCR和Northern杂交分析
• 2.2.8 红色暗柳橙和暗柳橙Lcyb的克隆与分析
• 2.2.8.1 实验材料
• 2.2.8.2 引物合成及PCR扩增
• 2.2.8.3 Southern杂交
• 2.2.8.4 CRED-RA分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中类胡萝卜素含量的变化
• 2.3.1.1 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实类胡萝卜素总量的变化趋势
• 2.3.1.2 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实类胡萝卜素各组分的变化趋势
• 2.3.2 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中Lcyb的克隆与分析
• 2.3.2.1 高质量RNA提取方法的改进和完善
• 2.3.2.2 红肉脐橙和华盛顿脐橙Lcyb的序列分析
• 2.3.2.3 红肉脐橙和华盛顿脐橙Lcyb的拷贝数
• 2.3.2.4 红肉脐橙和华盛顿脐橙Lcyb的PCR-RFLP分析结果
• 2.3.2.5 红肉脐橙和华盛顿脐橙Lcyb的表达模式分析
• 2.3.3 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中Psy的克隆与分析
• 2.3.3.1 红肉脐橙和华盛顿脐橙Psy的序列分析
• 2.3.3.2 红肉脐橙和华盛顿脐橙Psy的拷贝数分析
• 2.3.3.3 红肉脐橙和华盛顿脐橙Psy的表达模式分析
• 2.3.4 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中Lcye的克隆与分析
• 2.3.4.1 红肉脐橙Lcye的序列分析结果
• 2.3.4.2 红肉脐橙和华盛顿脐橙Lcye的拷贝数分析
• 2.3.4.3 红肉脐橙和华盛顿脐橙Lcye的RT-PCR表达模式分析
• 2.3.4.4 红肉脐橙和华盛顿脐橙Lcye包含选择性剪接位点的DNA序列分析
• 2.3.5 红肉脐橙和华盛顿脐橙中其他类胡萝卜素合成相关基因的分析
• 2.3.6 红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中的cDNA-AFLP分析
• 2.3.6.1 cDNA-AFLP分析结果
• 2.3.6.2 差异表达片段的RT-PCR模式分析
• 2.3.6.3 差异表达基因TDF6的克隆与分析
• 2.3.7 红肉脐橙等12个甜橙品种中的copia-like反转录转座子的研究
• 2.3.7.1 copia-like反转录转座子的RT序列分析
• 2.3.7.2 copia-like反转录转座子的的拷贝数分析
• 2.3.7.3 copia-like反转录转座子的表达模式分析
• 2.3.8 红色暗柳橙和暗柳橙Lcyb的克隆与分析
• 2.3.8.1 红色暗柳橙和暗柳橙Lcyb的序列分析结果
• 2.3.8.2 红色暗柳橙和暗柳橙Lcyb的拷贝数分析
• 2.3.8.3 红色暗柳橙和暗柳橙DNA甲基化状态改变位点的分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 脐橙红肉芽变的细胞学机制
• 2.4.2 脐橙红肉芽变的分子机制
• 2.4.2.1 Lcyb的差异表达
• 2.4.2.2 Psy的超量表达
• 2.4.2.3 Lcye的选择性剪接
• 2.4.2.4 DNA甲基化
• 2.4.2.5 其他因素的影响
• 2.4.3 基于本研究的后续工作
• 第三章 红肉脐橙果肉cDNA文库的构建及部分EST开发
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 cDNA合成
• 3.2.3 cDNA酶切、连接及转化
• 3.2.4 库容量和插入片段大小的分析
• 3.2.5 EST克隆的分析
• 3.2.6 两个与柑橘果实发育相关的全长cDNA克隆分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 总RNA提取
• 3.3.2 双链cDNA合成
• 3.3.3 文库质量检测
• 3.3.4 EST克隆的序列结果及分布
• 3.3.5 编码生长素抑制蛋白（Auxin-repressed）基因的cDNA克隆分析
• 3.3.6 编码MADS-box基因的cDNA克隆分析
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 红肉脐橙和红暗柳照片
• 附录Ⅱ 博士期间发表的论文
• 致谢