减毒沙门氏菌介导的禽呼肠孤病毒σB/σC基因疫苗的构建及其免疫特性研究

论文摘要

禽病毒性关节炎也称为传染性腱鞘炎,是由禽呼肠孤病毒（Avian reoviruses, ARV）引起的鸡和火鸡的一种以关节炎、腱鞘炎、吸收障碍为特征的免疫抑制病。该病可导致鸡的死亡率增加、病鸡增重减少、饲料转化率下降、产蛋下降、孵化率／受精率降低,因此给养禽业带来巨大经济损失。σC蛋白是禽呼肠孤病毒病毒外衣壳的主要组成部分,能诱导宿主产生群特异性中和抗体；σB蛋白是病毒外衣壳的次要组成成分,能诱导机体产生针对病毒的群特异性中和抗体,减毒沙门氏菌是应用较广泛的基因疫苗的载体。本研究根据ARV的σC蛋白和σB蛋白能诱导抗体产生以及减毒沙门氏菌可作为基因疫苗载体的特性,构建了减毒沙门氏菌介导的禽呼肠孤病毒基因疫苗,并对其免疫特性进行了研究。一、禽呼肠孤病毒σB、σC基因真核表达质粒的构建根据GenBank中发表的禽呼肠孤病毒S1133株σB基因的序列,设计一对引物,扩增GB基因,连入T载体,测序表明扩增的σB基因的大小为1130bp,将其与原核表达质粒pET32a（+）进行连接,成功构建了σB蛋白的原核表达载体,将其转入大肠杆菌BL21中进行表达,该蛋白在IPTG浓度为0.6mM、诱导时间在4h时得到了最佳表达,免疫印记分析表明表达的ARVσB蛋白具有较好的反应原性。将ARVσB基因与真核表达质粒pVAX进行连接,经酶切和PCR鉴定均出现1100bp的目的条带,表明真核表达质粒pVAX-aB构建成功；从已有真核表达载体pVAX-aC上扩增σC基因构建T载体,扩增的σC基因测序大小为1138bp,将其与双顺反子真核表达质粒pVAXAB相连,构建中间表达载体pVAXAB-aC,经PCR和Nhe1、HindⅢ双酶切鉴定均出现1138bp的目的条带,表明中间表达载体pVAXAB-σC构建成功,将σB基因与中间表达载体pVAXAB-σC相连,构建双顺反子真核表达质粒pVAXAB-σB-σC,经PCR和EcoRI、NotI双酶切鉴定均出现1100bp的目的条带,表明双顺反子真核表达质粒pVAXAB-σB-σC构建成功。将构建的真核表达质粒pVAX-σB、pVAXAB-σB-σC以及已有真核表达质粒pVAX-σC一起转染COS-7细胞,经间接免疫荧光检测表明所构建的质粒及已有质粒能够成功表达出目的蛋白并保持较好的反应原性。二、减毒沙门氏菌介导的禽呼肠孤病毒σB、σC基因疫苗的免疫特性研究将构建的真核表达质粒电转入减毒沙门氏菌SL7207,将SL7207 （pVAX-σB）以1.0×109CFU剂量免疫雏鸡,结果表明,所构建的疫苗对雏鸡有较高的安全性且在雏鸡体内至少存在10天。将SL7207 （pVAX-σB）、SL7207 （pVAX-σC）、SL7207 （pVAXAB-σB-σC）以1.0×109CFU的剂量每隔两周免疫雏鸡三次。抗体检测结果表明：首免后两周SL7207 （pVAX-σC）与空质粒SL7207 （pVAX1）以及PBS对照组相比产生了较高的血清抗体IgG （P<0.05）,而SL7207 （pVAXAB-σB-σC）与空质粒以及PBS对照组相比产生了较高水平的粘膜抗体IgA （P<0.01）;各疫苗免疫组在二免后第二周均能产生较高的血清抗体IgG和粘膜抗体IgA, SL7207 （pVAX-σC）与其它免疫组相比差异显著（P<0.01）；到三免后第二周各组抗体水平进一步升高,其中SL7207 （pVAX-σC）与SL7207 （pVAXAB-σB-σC）组较其它组产生了较高的血清抗体和粘膜抗体水平（P<0.01）。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 综述一 鸡病毒性关节炎研究进展
• 1 病毒性关节炎简介
• 2 病原学
• 2.1 病毒的分类及形态结构
• 2.2 病毒的理化特性
• 2.3 病毒血清型
• 3 病毒的基因组
• 4. 病毒的蛋白
• 4.1 结构蛋白
• 4.2 非结构蛋白
• 5 流行病学
• 6 临床症状
• 7 病理变化
• 8 诊断
• 9 疫苗研究
• 9.1 弱毒苗
• 9.2 油乳剂灭活苗
• 9.3 ARV基因工程疫苗
• 10 防制
• 综述二 减毒沙门氏菌简介
• 1 减毒沙门氏菌的减毒机理
• 2 减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的优点
• 3 减毒沙门氏菌入侵机制及免疫应答机理
• 4 减毒沙门氏菌在疫苗研究中的应用
• 研究目的及意义
• 第二部分 实验研究
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 试验动物
• 2 方法
• 2.1 ARV ΣB基因的克隆及原核表达质粒的构建
• 2.1.1 ARV σB σC蛋白基因的扩增
• 2.1.1.1 引物合成
• 2.1.1.2 ARV RNA的提取
• 2.1.1.3 ARV σB基因的RT-PCR扩增
• 2.1.2 σB基因的克隆与鉴定
• 2.1.2.1 DH 5α感受态细胞的制备
• 2.1.2.2 ARV σB基因的克隆与鉴定
• 2.1.2.3 ARV σB基因的核苷酸序列测定与分析
• 2.1.2.4 σB基因原核表达载体构建
• 2.1.2.5 σB蛋白的表达
• 2.2 ARVΣB基因与ΣC基因真核表达质粒的构建
• 2.2.1 真核表达质粒pVAX-σB的构建
• 2.2.1.1 σB与真核表达质粒pVAX 1.0的酶切
• 2.2.1.2 酶切产物的连接
• 2.2.1.3 ARVσB基因真核表达质粒的酶切及PCR鉴定
• 2.2.2 ARVσB基因σC基因双顺反子真核表达质粒pVAXAB-σB-σC的构建
• 2.2.2.1 中间质粒pVAXAB-σC的构建
• 2.2.2.2 真核表达质粒pVAXAB-σB-σC的构建
• 2.3 ARVΣB基因ΣC基因双顺反子真核表达质粒的体外表达
• 2.3.1 去内毒素质粒抽提
• 2.3.2 COS-7细胞的转染
• 2.3.2.1. 细胞复苏
• 2.3.2.2 细胞传代
• 2.3.2.3 转染方法
• 2.3.2.4 免疫荧光检测蛋白表达情况
• 2.4 减毒沙门氏菌介导的ARVΣB、ΣC基因疫苗的构建
• 2.4.1 减毒沙门氏菌SL7207感受态的制备
• 2.4.2 重组质粒pVAX1-σB、pVAXAB-σB-σC电转化感受态SL7207及其鉴定
• 2.5 重组沙门氏菌介导的ARVΣB、ΣC基因疫苗的免疫特性实验
• 2.5.1 重组沙门氏菌的体内稳定性实验
• 2.5.2 重组沙门氏菌的安全性实验
• 2.5.3 重组减毒沙门氏菌介导的ARVσB基因疫苗的免疫原性实验
• 2.5.3.1 重组减毒沙门氏菌介导的ARVσB疫苗的制备
• 2.5.3.2 重组沙门氏菌介导的ARVσB、σC基因疫苗的免疫特性实验
• 3 结果与分析
• 3.1 ARV σB基因的RT-PCR扩增结果
• 3.2 ARV σB基因重组质粒pMD19T-σB的鉴定
• 3.3 σB基因原核表达载体构建
• 3.4 σB蛋白的初步表达
• 3.4.1 σB蛋白的初步表达
• 3.4.2 σB蛋白的诱导条件的优化
• 3.4.3 σB蛋白的免疫印记分析
• 3.5 重组质粒pVAX-σB的鉴定
• 3.6 重组质粒pVAXAB-σB-σC的鉴定
• 3.6.1 ARV σC基因重组质粒pMD19T-σC的鉴定
• 3.6.2 中间质粒pVAXAB-σC的鉴定结果
• 3.6.3 双顺反子真核表达质粒pVAXAB-σB-σC的鉴定
• 3.7 真核表达质粒pVAX-σB、pVAX-σC、pVAXAB-σB-σC的体外表达结果
• 3.8 减毒沙门氏菌介导的ARV σB、σC基因疫苗的构建
• 3.9 重组沙门氏菌的体内稳定性实验
• 3.10 重组沙门氏菌的安全性实验
• 3.11 重组沙门氏菌介导的ARV σB、σC基因疫苗的免疫特性实验
• 3.11.1 血清IgG的检测
• 3.11.2 肠粘膜IgA抗体的检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间发表文章