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沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌的同步快速检测方法的研究

2020-12-10阅读(758)

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌的同步快速检测方法的研究

论文摘要

食源性疾病在食品安全问题中至关重要,包括食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、肠源性病毒感染等。近10年来,在我国由微生物引起的食源性疾病事件中,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别占17.9%和8.9%,是最常见和最主要的致病菌。有资料统计,在我国70%～80%的细菌食物中毒是由沙门氏菌引起的。单增李斯特菌污染食品而引起的恶性中毒事件,在美国、墨西哥、法国多次发生,病死率达30～70%。因此,找出快速有效的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测和监控方法,对于保证食品安全有着重要的意义。在本研究中,根据现有通用增菌液及选择性增菌液,设计制备了一种能够同时富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌的复合增菌肉汤。通过单因素实验挑选出合适添加剂,并采用响应面分析对培养基成份进行了优化,最后得到SSL配方如下:胰蛋白胨17g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L、丙酮酸钠2.5g/L、甘露醇5g/L、氯化钠15g/L、氯化锂2g/L、亚碲酸钾1mg/L、萘啶酮酸10mg/L。经验证SSL可使得三种目标菌以相对一致的速度进行富集,经过37℃150r/min振荡培养24h后,菌体浓度到达107~108CFU/mL,非目标菌生长受到抑制。针对沙门氏菌的invA基因,金黄色葡萄球菌的sa442基因及单增利斯特菌的hly基因成功设计了三对引物和三条特异性探针,进行多重PCR扩增,并在此基础上进行病原菌的液相芯片检测。经过优化PCR产物与探针杂交的温度,得到杂交条件为52℃,20min,检测灵敏度可达100CFU/mL。通过人工污染样品的检测和实际食品样品的检测,验证了SSL(S.enteritidis; S.aureus; L.monocytogens的复合增菌培养基)复合增菌技术及液相芯片检测体系的检测效果,预增菌及液相芯片检测全过程可在24h内完成,检测灵敏度可达到10CFU/mL。本研究所建立的液相芯片检测方法在上述三种致病菌的快速和多重检测上是可行的。结果表明其具备良好的重复性、特异性和灵敏性特点。与国标法相比,检测时间减少,准确性提高,且可满足多重检测的要求。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 食品安全问题及食源性疾病的危害
  • 1.2 三种食源性致病菌的病原学及流行病学研究进展
  • 1.2.1 沙门氏菌的病原学及流行病学研究
  • 1.2.2 金黄色葡萄球菌的病原学及流行病学研究
  • 1.2.3 单增李斯特菌的病原学及流行病学研究
  • 1.3 三种食源性致病菌的增菌技术研究进展
  • 1.3.1 沙门氏菌增菌方法
  • 1.3.2 金黄色葡萄球菌增菌方法
  • 1.3.3 单增李斯特菌增菌方法
  • 1.4 共增菌技术的研究现状
  • 1.4.1 现有共增菌培养基
  • 1.4.2 共增菌培养基的基础成分
  • 1.4.3 共增菌培养基中抑制剂和促进剂的研究
  • 1.5 三种食源性致病菌的分子生物学检测方法研究现状
  • 1.5.1 多重PCR 检测方法
  • 1.5.2 实时荧光定量PCR 检测方法
  • 1.5.3 核酸探针技术
  • 1.5.4 生物芯片技术
  • 1.5.5 液相芯片技术
  • 1.6 立题依据
  • 1.7 研究内容和技术路线
  • 第二章 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌复合增菌培养基的研制
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料与设备
  • 2.2.1 菌株
  • 2.2.2 主要试剂
  • 2.2.3 实验仪器设备
  • 2.3 实验及分析方法
  • 2.3.1 菌种的保藏及菌悬液的制备
  • 2.3.2 基础培养基的制备
  • 2.3.3 抑制剂及促进剂的筛选
  • 2.3.4 响应面分析法优化复合增菌培养基
  • 2.3.5 培养温度的优化
  • 2.3.6 复合增菌培养基pH 值的优化
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 抑制剂及促进剂筛选
  • 2.4.2 响应面实验优化配方成分
  • 2.4.3 培养温度的选择
  • 2.4.4 复合增菌培养基 pH 值的选择
  • 2.5 本章小结
  • 第三章 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌复合增菌培养基的评价
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料与设备
  • 3.2.1 菌株
  • 3.2.2 主要试剂
  • 3.2.3 实验样品
  • 3.2.4 主要仪器设备
  • 3.3 实验及分析方法
  • 3.3.1 增菌培养基的配制
  • 3.3.2 SSL 的单菌增菌效果的验证
  • 3.3.3 SSL 的复合增菌效果的验证
  • 3.3.4 SSL 对非目标菌增菌效果的验证
  • 3.3.5 SSL 对冷损伤菌及热损伤菌的复苏
  • 3.3.6 人工接种样品的检测
  • 3.3.7 实际污染样品的检测
  • 3.3.8 三重荧光PCR 检测
  • 3.3.9 统计方法
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 SSL 肉汤单菌增菌效果
  • 3.4.2 SSL 肉汤复合增菌效果
  • 3.4.3 非目标菌的在SSL 肉汤中的复苏效果
  • 3.4.4 SSL 对冷损伤菌及热损伤菌的复苏效果
  • 3.4.5 人工接种样品的检验
  • 3.4.6 实际样品的检验
  • 3.5 本章小结
  • 第四章 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌液相芯片检测方法的建立
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料与设备
  • 4.2.1 菌株
  • 4.2.2 主要试剂
  • 4.2.3 实验仪器设
  • 4.3 实验及分析方法
  • 4.3.1 引物探针的设计
  • 4.3.2 DNA 模板的制备
  • 4.3.3 单重PCR 反应体系的建立
  • 4.3.4 多重PCR 反应体系的建立
  • 4.3.5 探针与微球的偶联及交联效率的验证
  • 4.3.6 液相芯片仪的使用和结果判定
  • 4.3.7 单菌的液相芯片检测体系的建立
  • 4.3.8 杂交温度的优化
  • 4.3.9 上游引物标记生物素对检测信号的影响
  • 4.3.10 三种目标菌的液相芯片检测体系确立
  • 4.3.11 液相芯片检测体系重复性验证
  • 4.3.12 液相芯片检测体系特异性验证
  • 4.3.13 液相芯片检测体系灵敏度验证
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 引物与探针
  • 4.4.2 单重PCR 扩增结果
  • 4.4.3 多重PCR 扩增结果
  • 4.4.4 探针及微球的偶联效果检测
  • 4.4.5 单菌的液相芯片检测体系的建立
  • 4.4.6 杂交温度的优化
  • 4.4.7 上游引物标记生物素对检测信号的影响
  • 4.4.8 三种目标菌液相芯片检测体系的确立
  • 4.4.9 三种菌的液相芯片检测体系的重复性验证
  • 4.4.10 三种菌的液相芯片检测体系的特异性验证
  • 4.4.11 三种菌的液相芯片检测体系的灵敏性验证
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌液相芯片检测体系的应用
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验材料与设备
  • 5.2.1 菌株
  • 5.2.2 主要试剂
  • 5.2.3 主要仪器设备
  • 5.2.4 样品
  • 5.3 实验及分析方法
  • 5.3.1 人工接种样品的检测
  • 5.3.2 实际食品样品的检测
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 人工接种样品的检验
  • 5.4.2 实际食品样品的检验
  • 5.5 本章小结
  • 结论与展望
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间取得的研究成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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