高蕴1傅剑云2鹿伟2（1桐乡卫生局314500;2浙江省疾控中心310000）
【摘要】目的对一种二氧化氯消毒液的遗传毒性进行探讨，对其应用于饮水消毒的安全性进行评价。对彗星试验应用于消毒剂的安全性评价进行研究。方法按《单细胞凝胶电泳体内外遗传毒性试验指南》（2000）[2]进行彗星试验。在5mg/ml的剂量下ClO2消毒液作用于小鼠肝原代细胞，其彗星试验尾长与阴性对照比较差异无显著性。结论该二氧化氯消毒液无致突变性,是一种良好的饮用水消毒剂，长期饮用不会致机体产生遗传毒性效应。彗星试验是一种良好的评价消毒剂遗传毒性的方法。
【关键词】二氧化氯遗传毒性彗星试验
饮用水消毒一直以来都是一个密切关系人类健康的问题。二氧化氯是广谱型消毒剂，易溶于水，对经水传播的病源微生物，包括病毒、芽孢以及水路系统中的异氧菌、硫酸盐还原菌和真菌均有很好的消毒效果。国内部分水厂将其作为饮水氯消毒的替代方法。同时，其本身存在的潜在危害性也不容忽视。
本研究着眼于二氧化氯的遗传毒性，通过彗星试验，评价二氧化氯的遗传毒性，为二氧化氯本身的毒理学安全性评价积累资料。
1.材料和方法
1.1试验动物实验用ICR小鼠，由浙江中医学院实验动物中心提供，清洁级，体重25-30g。动物饲料由浙江省实验动物中心提供。检测环境条件：温度范围21-23℃，相对湿度范围55-70％。
1.2受试物二氧化氯消毒液，比重0.9893(20℃测定)，pH值为2.4,易溶于水。实验前，配备。
1.3试剂
1.3.1重铬酸钾（K2Cr2O7）：分析纯，纯度大于98%。
1.3.2正常熔点琼脂糖（NMPA）：PROMAGE分装，室温保存。使用时用磷酸盐缓冲液（PBS）配置成0.8%的浓度。
1.3.3低熔点琼脂糖（LMPA）：PROMAGE公司分装，室温保存。使用时用磷酸盐缓冲液（PBS）配置成0.8%的浓度。
1.3.4溴化乙锭（EB）：SIGMA公司分装，配置成4mg/ml储备液，4℃避光保存，临用时用蒸馏水稀释至20μg/ml，作为应用液。
1.3.5肌氨酸钠（N-Lauroyl-sarcosinesodiumsalt）:SIGMA公司分装，室温保存,纯度大于94%。
1.3.6TritonX-100：BIB公司生产，室温保存。
1.3.7细胞裂解液配方：100mmol/L乙二胺四乙酸二钠（Na2edta）,1%的肌氨酸钠，10mmol/l三（羟）甲基氨基甲烷（Tris）,2.5mmol/L氯化钠（NaCl）,依次加热溶解，用氢氧化钠(NaOH)调节PH=10，置4℃冰箱保存。临用前加入10%二甲亚砜（DMSO），1%TristonX-100。
1.3.8碱性电泳缓冲液配方：1mmol乙二胺四乙酸二钠（Na2edta）,300mmolNaOH,依次加热溶解，加蒸馏水至1000ml,PH＞13。
1.4方法
彗星试验
单细胞制备：股动脉放血处死小鼠，取出整块肝脏放在滤纸上除去被膜及血迹后放入小烧杯内，加入少量预冷的PBS液清洗后，用眼科剪略剪碎，200目的不锈钢筛网过滤，收集细胞悬液，用PBS液稀释，调细胞浓度至107-108/ml,置冰浴中待用。并以台盼蓝染色观察细胞存活率。
暴露：按照悬浮暴露方法进行操作，取上述制备好的细胞悬液按每管105-106个细胞分装于5ml刻度离心管，在不同的离心管中用PBS液将体积加至5ml。于一离心管中加50mmol/LK2Cr2O7溶液50μl，使染毒浓度约为0.5mmol/L，作为阳性；于另一离心管中加样品原液5μl，使暴露浓度约为5mg/ml（预试显示该浓度下37℃1.0h，细胞存活率＞90%）；阴性对照管不加任何试剂。于37℃孵箱染毒1.0h，染毒期间用滴管不定时地混匀细胞。染毒完毕于1500r/min离心5min，弃掉上清液，加PBS液5ml重悬细胞再离心一次。最后于沉淀中加500μlPBS液重悬细胞用于彗星试验。
制片：第一层胶制备：取45℃0.8%的NMPA135μl浇注到磨砂载玻片上，迅速加盖玻片，使胶均匀铺开后4℃固化10min。第二层胶制备：取下盖玻片，将细胞悬液以1：7的体积与37℃0.8%LMPA混合，取75μl加到第一层胶上，盖上盖玻片，4℃固化10min。
裂解：取下盖玻片后，将载玻片浸于新鲜配制的冰冷的裂解液中，避光低温裂解1h。
解旋：从裂解液中取出载玻片，用蒸馏水将其充分清洗后，置于水平电泳槽中，液面高于载玻片2.5mm左右，室温避光解旋30min。
电泳：将电压调至20V，调整电泳液液面的高度，使电流保持200mA，室温避光电泳30min。
漂洗及染色：电泳结束后，取出载玻片，用蒸馏水漂洗3次，每次3min,稍微晾干，在暗处滴加20μl20μg/ml的EB，盖上盖玻片，保存于湿盒中备检。
观察指标：于荧光显微镜下观察彗星尾长。将尾长分为0-5六个级别，每个级别显示的数字表示该彗星尾长相当于多少倍的头长。例如：尾长级别为4表示该彗星的尾长相当于4倍头长。采用秩和检验进行统计学处理。
2.实验结果
二氧化氯消毒液作用于小鼠肝原代细胞的彗星试验结果见表1。尾长级别代表了彗星拖尾程度。级别数字代表了彗星拖尾长度相当于多少倍彗星头长的距离。数字越大说明拖尾越严重。例如：0表示无拖尾，5代表拖尾长度等于或大于5倍彗星头长。将表3结果反应为交互直方图（见图1），可更直观的看出：阴性和二氧化氯消毒液作用于小鼠肝原代细胞，彗星结果拖尾程度较轻，尾长级别基本在1-2的范围；阳性结果拖尾程度较重，尾长基本在2-5的范围。
图1：彗星试验结果交互直方图
表1彗星试验结果
统计分析采用秩和检验（Wilcoxon两样本比较法），结果如下：
阴性对照与二氧化氯消毒液分别处理的小鼠肝细胞彗星试验结果相比较uc=0.53,查表P＞0.05，按α=0.05水准，可认为两者处理的小鼠肝细胞彗星试验结果之间无显著性差异。
同理得：阴性对照与重铬酸钾分别处理的小鼠肝细胞彗星试验结果相比较uc=6.14，查表P＜0.001，按α=0.05水准,可认为两者处理的小鼠肝细胞彗星试验结果之间有显著性差异。
说明该二氧化氯消毒液对体外小鼠肝原代细胞DNA基本无致断裂作用。
3.讨论和结论
饮用水消毒剂的开发很重要，关系到每个人的健康，市场上的消毒剂很多，二氧化氯是其中一种比较好的消毒剂，但其潜在存在的危害性也不容忽视。
本研究对一种二氧化氯消毒液的遗传毒性进行了探讨。以彗星试验尾长为观察指标，结果显示该样品不是DNA损伤剂。说明二氧化氯是一种良好的饮用水消毒剂，无致突变性、长期饮用不会致机体产生遗传毒性效应。
在《消毒技术规范》（2002）标准中，彗星试验八十年代末建立，经过十多年的发展完善基本成熟。与标准中常规致突变试验相比，该方法最大的优点是敏感性高，快速。将其应用于消杀样品的检测，在保护人类健康方面将发挥重要的作用。
结论：本实验条件下，该二氧化氯消毒液无致突变性,是一种良好的饮用水消毒剂，长期饮用不会致机体产生遗传毒性效应。彗星试验是一种良好的评价消杀样品遗传毒性的方法。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部消毒技术规范.消毒新产品检验技术规范，2002.
[2]黄晓波，郑国立.几种消毒剂的毒性研究.中国卫生检验杂志,1004-8685（2002）03-0290-02
[3]赵蓉,衡正昌.彗星试验非荧光染色研究.环境与健康杂志,2002,19(2).