体外三维培养条件下肝癌细胞侵袭、转移的实验研究

论文摘要

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌中最主要的、最普遍的一种,并以高死亡率在世界范围位列癌症的第六位。HCC具有进展速度快,病灶转移广,预后效果差,难治愈易复发的特点。HCC细胞的这种高转移潜能和其与细胞外微环境（主要包括间质细胞、细胞外基质蛋白、可溶性细胞因子以及生长因子等）相互作用密切相关。传统的二维（two-dimensional, 2D）细胞培养系统因很少引入细胞外基质而不能提供一个很好的细胞生长微环境支持肿瘤-间质的相互作用,进而不能在HCC的黏附、侵袭和转移的分子作用机制方面更好进行研究。因此,运用再造细胞外基质（比如collagen I、Matrigel等）的三维细胞培养模型（three-dimensional, 3D）建立起来了。3D细胞培养模型在体外构建与体内相近的细胞发育结构系统,能更好模拟细胞生长的微环境,体现肿瘤细胞和间质细胞间的相互作用过程,反映肿瘤细胞和间质之间作用的机理;还能重现人体肿瘤细胞局部黏附、侵袭以及远端转移的过程,以便于对肿瘤黏附,迁移和侵袭的分子作用机制更好的研究。HAb18G/CD147分子高表达于HCC等多种恶性肿瘤,是CD147分子超家族中的一员。研究显示在2D细胞培养条件下,HAb18G/CD147分子在HCC黏附、侵袭和转移方面起到重要的作用。本课题的研究目的是:（1）建立HCC的3D细胞培养模型;（2）运用HCC的3D细胞培养模型研究细胞外微环境在肝癌细胞以及间质细胞表型形成中的作用;（3）运用HCC的3D细胞培养模型研究HAb18G/CD147分子在调节MMPs分泌活化和黏附因子表达中的作用,进而深入研究HAb18G/CD147分子在HCC黏附、侵袭和转移方面的分子机制。本课题共分三个部分:（1）运用细胞外基质Matrigel胶建立HCC的3D细胞培养模型;（2）在3D细胞单培养条件下观察HCC细胞骨架分布、HAb18G/CD147分子表达、MMPs合成活化以及一些关键黏附蛋白表达的改变（;3）应用HCC细胞和成纤维细胞3D共培养模型深入研究HAb18G/CD147分子在肿瘤细胞和间质细胞的MMPs合成活化以及关键黏附蛋白表达中的作用。我们采用融化的Matrigel胶重悬细胞的方法成功建立了HCC的3D细胞培养模型。在HCC细胞3D单培养条件下,细胞外基质在HCC细胞的表型形成中起到了重要的决定作用,该培养条件可以促进人SMMC-7721肝癌细胞中HAb18G/CD147分子高表达进而上调MMPs（MMP2和MMP9）分泌活化,同时HAb18G/CD147的过表达伴随E-cadherin、paxillin、FAK和p-FAK的表达上调以及F-actin的重排。在HCC细胞和成纤维细胞3D共培养条件下,人FHCC-98肝癌细胞和NHDF细胞中过表达的HAb18G/CD147分子可以提高这两种细胞的MMPs（MMP2和MMP9）的分泌和活化水平,同时还可以激活这两种细胞内integrin下游信号通路,最终决定间质细胞和肿瘤细胞的表型,进而增强了肝癌细胞黏附、侵袭和转移的潜能。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 实验内容
• 实验一 应用MATRIGEL 胶建立HCC 的3D 细胞培养模型
• 1 材料
• 1.1 主要实验器材
• 1.2 主要实验试剂
• 1.3 细胞株
• 1.4 主要缓冲试剂
• 2 方法
• 2.1 2D 细胞培养
• 2.2 3D 细胞培养
• 3 结果
• 3.1 Matrigel 胶和培养基按不同比例混合条件下，不能建立HCC 的3D细胞培养模型
• 3.2 细胞接种于 Matrigel胶表面和重悬于Matrigel胶中可以形成细胞的3D 生长
• 4 讨论
• 实验二 运用3D 单细胞培养模型研究HCC 在黏附、侵袭和转移方面的分子机制
• 1 材料
• 1.1 主要实验器材
• 1.2 主要实验试剂
• 1.3 细胞株
• 1.4 主要缓冲试剂
• 2 方法
• 2.1 细胞培养与形态学观察
• 2.2 间接免疫荧光实验
• 2.3 免疫印记实验（Western blotting）
• 2.4 明胶酶谱实验
• 2.5 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 人SMMC-7721 肝癌细胞在3D 细胞培养模型中形态出现明显变化
• 3.2 间接免疫荧光结果
• 3.3 免疫印记实验结果
• 3.4 明胶酶谱实验结果
• 4 讨论
• 实验三 应用3D 细胞共培养模型研究HCC 在黏附、侵袭和转移方面的分子机制
• 1 材料
• 1.1 主要实验器材
• 1.2 主要实验试剂
• 1.3 细胞株
• 1.4 主要缓冲试剂
• 2 方法
• 2.1 细胞共培养方法
• 2.2 间接免疫荧光实验
• 2.3 明胶酶谱实验
• 2.4 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 人FHCC-98 肝癌细胞和NHDF 细胞在3D 细胞共培养模型中细胞形态的变化
• 3.2 间接免疫荧光结果
• 3.3 明胶酶谱实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢