论文摘要
低分子量麦谷蛋白（LMW-GS）在小麦籽粒中含量丰富,对小麦的加工品质有着不可忽视的作用。然而由于小麦LMW-GS是一个复杂的家族,因而对它的研究较为困难。迄今,LMW-GS的研究已远远落后于高分子量谷蛋白（HMW-GS）和醇溶蛋白,我国对LMW-GS的遗传变异及其对品质的影响研究尚处于起步阶段。本实验旨在对小麦籽粒中LMW-GS进行初步的鉴定,并进一步对其编码基因进行克隆及序列分析,从而丰富LMW-GS基因家族,以期为利用优质LMW-GS对小麦的品质改良提供一定的理论参考。本研究共选用6个普通小麦品种（品系）：R146、H6、美国硬红、美国软红、R111、R291（其中R146、R111、R291由四川农业大学作物遗传育种重点实验室提供,H6、美国软红、美国硬红由国际小麦玉米改良中心提供）。采用SDS-PAGE技术对LMW-GS进行分析鉴定,根据LMW-GS编码区特性,自行设计了5对LMW-GS特异性引物（LMW-1、LMW-2、LMW-3、LMW-4、LMW-5）对材料进行PCR扩增,并对克隆所得的DNA序列进行比对分析、蛋白质二级结构预测以及系统进化分析,其结果如下：1.采用SDS-PAGE技术对6份小麦材料的LMW-GS进行初步的分离鉴定,结果表明,LMW-GS根据分子量大小的不同,在SDS-PAGE图谱上主要分成B亚基和C亚基两个区域,在部分品种含有D亚基。实验克隆所得的新基因LMW-H6-5-2 （GeneBank登录号为JF736507）编码的LMW-GS,分子量大小约为38.0KD,位于C亚基区域。2.通过PCR克隆技术,共得到18个有效基因序列（4个来自R146,4个来自H6,2个来自美国硬红,4个来自美国软红,2个来自R111,2个来自R291）。其中14个具有完整的编码LMW-GS的ORF阅读框,4个由于编码区存在提前终止密码子而不能编码成熟蛋白的假基因。在克隆所得的LMW-GS基因编码区的上游序列中含有TATA框、CAAT框以及胚乳框,其编码的氨基酸序列都具有典型的LMW-GS结构：20个氨基酸组成的信号肽区（Sig）；13个氨基酸组成的N-末端保守区（Ⅰ）；70-186个氨基酸组成的富含谷氨酰胺Q和脯氨酸P的中央重复区（Ⅱ）；含5个半胱氨酸残基（C残基）的C-端半胱氨酸富含区（Ⅲ）；含一个C残基的C-端谷氨酰胺Q的富含区（Ⅳ）；含有最后一个C残基的C-末端保守区（Ⅴ）。它们都含有8个C残基,其中有8个LMW-GS的第1个C残基位于Ⅰ区,10个LMW-GS的第1个C残基位于11区,未发现8个C残基都位于C-末端区的情况。由于C残基的分布不同,这些蛋白的功能之间也不同,但目前其机理尚不清楚。3.通过序列比对分析,发现这18个序列与小麦族物种中LMW-GS的基因序列有较高的一致性,可以表明其为低分子量谷蛋白亚基序列,其中LMW-H6-5-2所编码的亚基是一个新的LMW-GS,与NCBI上已发表的氨基酸序列比对,其中相似度最高的为ABM66824,相似度仅为74%。二者在中央重复区的重复单位及重复单位的数量上都存在较大差异,且Q含量与分布也有所不同。4.采用PSIPRED v3.0二级结构预测方法对LMW-H6-5-2编码的新亚基以及优质亚基ABY263369进行了蛋白质二级结构的预测,结果表明：与ABY263369相比,LMW-H6-5-2编码的新亚基的β-折叠的数量相同,含量相对要高一些,故而推测其可能为优质亚基。但根据其分子量,它又属于C型亚基,而有研究曾表明C型亚基往往与不良品质相关,因此不能单一的根据β-折叠的含量来判断亚基的优劣,同时也应考虑α-螺旋的数量以及分布情况对小麦品质的影响,LMW-H6-5-2编码的新LMW-GS对小麦的品质的实际影响情况还需要进一步的实验研究。5.采用DNAMAN软件,对克隆所得的18个基因序列进行聚类分析,结果表明：由于克隆得到的18个基因序列所编码的LMW-GS都属于LMW-m型亚基,其相互间同源性较高,相对亲缘关系较近。从不同品种中克隆得到的基因序列,尽管采用的引物存在不同,但部分序列间仍表现出较高的相似性,说明不同品种间也具有相似的基因类型,这些基因可能起源于同一原始祖先位点。