猪圆环病毒2型检测新方法研究

论文摘要

猪圆环病毒2型（PCV2）可以引起很多疾病尤其是断奶仔猪多系统衰竭综合症,这种病给世界养猪业造成了巨大的经济损失。现有的PCV2的检测方法虽然对该病的诊断起到了重要作用,但难以满足现场实时快速检测的要求。因此,发展和建立PCV2早期检测新方法对于该病的检测和诊断具有重要意义。本论文结合化学发光免疫分析技术（CLIA）、乳胶凝集技术及荧光显微镜技术,采用金标单克隆抗体探针、乳胶抗体复合物探针和量子点荧光探针研究了PCV2的检测新方法,主要研究内容及结果如下：1.合成了金纳米粒子并制备了金标单克隆抗体,对二者进行了紫外、透射电镜的表征,研究了纳米金溶解及化学发光的条件,建立了一种超灵敏、简便、快速、特异性强、重复性好的Au3+增强的CLIA检测PCV2,检测限达到2.67×102copy/mL。与PCR相比,通过检测36份临床血清样本,CLIA检测PCV2显示出了高的灵敏度和可靠性,在临床分析和控制疾病传播方面显示出了更好的前景。2.合成了带有磺酸基的三元聚合物乳胶微球,通过静电相互作用,将PCV2单克隆抗体吸附到乳胶微球表面形成乳胶抗体复合物诊断试剂。乳胶抗体复合物诊断试剂表面抗体与病毒表面抗原发生特异性反应,促使分散的乳胶微球凝集在一起,出现肉眼可见的凝集现象,而与去离子水、磷酸缓冲液、猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒不出现凝集现象。在最优化条件下,病毒浓度检测范围为3.1×105 copy/mL-8.00×107 copy/mL,检测限达到1.0×105 copy/mL。用建立的方法与PCR方法检测了34份临床血清样本,结果表明该方法可用于临床血清样品的检测,是一种简单、快速、灵敏的PCV2可视化检测方法。3.合成了CdTe量子点,并构建了CdTe-PCV2单克隆抗体荧光探针。通过荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、动态光散射、琼脂糖凝胶电泳、荧光显微镜等表征手段证明量子点荧光探针具有量子点的荧光特性和单克隆抗体的生物特异性。研究结果表明CdTe-PCV2单克隆抗体荧光探针在PK15细胞中可以特异性识别PCV2。本研究将纳米探针用于PCV2检测新方法的研究,不仅提供了高灵敏、简便快速、可视化的PCV2检测方法,还为PCV2检测试剂盒的制备、PCV2致病机理的研究以及纳米探针用于其他重大动物疾病的研究提供了重要参考依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 简略词表
• 第一章 绪论
• 1 猪圆环病毒病简介
• 2 猪圆环病毒病检测方法及研究现状
• 3 纳米探针技术在动物疾病检测中的应用
• 3.1 纳米探针制备方法
• 3.2 纳米金免疫技术
• 3.3 化学发光免疫分析技术
• 3.3.1 化学发光免疫分析技术原理
• 3.3.2 化学发光免疫分析类型及应用
• 3.4 乳胶凝集检测技术
• 3.5 量子点荧光探针技术
• 3.6 纳米传感器检测技术
• 3.7 微流控技术
• 3.8 纳米基因芯片技术
• 4 论文设计思想
• 第二章 化学发光免疫分析法高灵敏的检测猪圆环病毒2型
• 1 前言
• 2 材料与主要仪器
• 2.1 材料
• 2.2 主要仪器
• 3 实验方法
• 3.1 纳米金的制备
• 3.2 金标单克隆抗体的制备
• 3.3 纳米金的溶解和化学发光条件的优化
• 3.4 化学发光免疫分析法检测PCV2
• 3.5 PCR法检测PCV2
• 4 实验结果与讨论
• 4.1 金纳米粒子和金标单克隆抗体探针的表征
• 4.2 纳米金溶解条件的优化
• 4.3 化学发光条件的优化
• 4.4 化学发光免疫分析法检测PCV2结果
• 4.5 对比实验结果
• 5 结论
• 第三章 乳胶凝集法可视化检测猪圆环病毒2型
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 主要仪器
• 3 实验方法
• 3.1 苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸丙基磺酸钾乳胶的制备
• 3.2 乳胶抗体复合物诊断试剂的制备
• 3.3 LAT操作步骤和结果的判定
• 4. 实验结果与讨论
• 4.1 乳胶的制备
• 4.2 乳胶偶联抗体条件的优化
• 4.2.1 最佳偶联抗体量的优化
• 4.2.2 最佳偶联时间的优化
• 4.3 乳胶抗体复合物诊断试剂自凝检测
• 4.4 LAT检测结果
• 4.5 敏感性实验
• 4.6 特异性实验
• 4.7 对比实验结果
• 5 结论
• 第四章 荧光显微镜技术检测PK15细胞中猪圆环病毒2型
• 1 前言
• 2 材料和主要仪器
• 2.1 材料
• 2.2 主要仪器
• 3 实验方法
• 3.1 谷胱甘肽修饰的CdTe量子点的制备
• 3.2 CdTe/Ab荧光探针的制备
• 3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 3.4 荧光显微镜技术检测PCV2
• 4 实验结果与讨论
• 4.1 CdTe量子点的光学特性
• 4.2 CdTe/Ab荧光探针的表征
• 4.3 CdTe/Ab荧光探针的生物特性研究
• 4.4 PK15细胞中PCV2检测结果
• 5 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录