转蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶基因甘蔗的抗旱性研究

论文摘要

果聚糖是一种以蔗糖为底物由果糖基转移酶催化合成的果糖基聚合物,存在于约15%的被子植物中。除了作为植物重要的贮藏性碳水化合物外,果聚糖还有许多重要生理功能。果聚糖在干旱、高盐等非生物胁迫下作为渗透保护物质参与渗透调节,防止细胞失水,同时通过与膜磷脂双分子极性头部互作抑制生物膜的融合,抑制流体膜向胶体膜的转变,从而稳定磷脂双分子层天然构象维护膜的稳定性。植物中果聚糖的代谢是植物调节环境胁迫的一种重要机制,它的积累可以使植物在多种环境胁迫下的抗逆性增强。果聚糖还是优良的水溶性膳食纤维,是完全符合益生元标准的典型双歧因子,对人类健康具有很好的促进作用。果聚糖的合成是由一组果糖基转移酶催化完成的,蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶（sucrose:sucrose-1-fructosyltransferase,1-SST）是其中的关键酶之一,1-SST首先催化两个蔗糖分子形成一个蔗果三糖分子,同时释放一个葡萄糖分子。果聚糖链的延伸则是由其他果聚糖合成酶,如1-FFT,6G-FFT和6-SFT等通过p-2,6键或β-2,1键这两种糖苷键的连接完成的。通过转化果聚糖转移酶基因包括1-SST,1-FFT等提高植物抗逆性已有很多成功的例子。甘蔗作为食糖的主要生产原料,本身具有丰富的果聚糖合成底物,是转化果聚糖合成酶基因的理想材料。本实验室对1-SST基因的前期遗传转化研究中,已获得了35株rbcS启动子驱动1-SST基因的甘蔗转化植株。本研究在此基础上,通过PCR和RT-PCR对这35个株系进行进一步的分子检测,筛选其中5个在mRNA水平上有表达的株系进行了低聚果糖的HPLC检测,结果检测到了蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶的催化产物GF2,说明1-SST基因已经整合到甘蔗中并稳定表达,目的基因产物蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶催化蔗糖合成了蔗果三糖。对这5个转化株系进行了抗逆实验,通过对保水率、电导率,MDA、脯氨酸、叶绿素和SOD活性等生理和生长指标的测定,发现转基因植株的抗旱及耐盐性均有了不同程度的提高,说明1-SST基因导入甘蔗可以提高甘蔗的抗逆性。植物根部在抗旱、耐盐和抗冷害上有重要的作用,为进一步提高1-SST基因在甘蔗植株中的抗逆效果,本研究用在甘蔗根中有较强启动表达能力的pPST2a启动子替换了原来的rbcS启动子重新构建了植物表达载体,并利用农杆菌介导法对甘蔗进行遗传转化,通过PCR检测获得了93株阳性植株,对部分阳性植株幼苗进行了部分的抗逆性实验,也发现了转化植株具有较强的抗旱和抗盐性。待植株进一步长大,更多的抗逆性实验将进一步进行。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言与文献综述
• 1.1 甘蔗简介
• 1.1.1 甘蔗的生物学性质
• 1.1.2 甘蔗的经济价值
• 1.1.2.1 甘蔗是重要的糖料作物
• 1.1.2.2 甘蔗是重要的能源作物
• 1.1.2.3 甘蔗副产品的利用
• 1.1.3 甘蔗作为转基因受体的优点
• 1.2 果聚糖概述
• 1.2.1 果聚糖的分类
• 1.2.2 果聚糖的功能
• 1.2.2.1 果聚糖在植物中的作用
• 1.2.2.1.1 果聚糖与植物的抗逆性
• 1.2.2.1.2 果聚糖的抗逆性机制
• 1.2.2.1.2.1 参与渗透调节
• 1.2.2.1.2.2 非生物胁迫下维持膜稳定性
• 1.2.2.2 果聚糖在制药方面的应用及其与人类健康的关系
• 1.2.2.3 果聚糖在食品行业中的应用
• 1.2.3 果聚糖代谢的关键酶及其研究进展
• 1.2.3.1 果聚糖的合成
• 1.2.3.2 果聚糖的降解
• 1.2.4 蔗糖:蔗糖果糖基转移酶1-SST的酶学性质
• 1.2.5 与植物抗逆性及果聚糖积累的有关基因工程介绍
• 1.2.5.1 利用果聚糖提高植物抗逆性的相关基因工程
• 1.2.5.2 提高果聚糖积累的相关基因工程
• 1.3 植物的逆境生理以及抗逆性机制
• 1.3.1 渗透胁迫与渗透调节
• 1.3.2 细胞膜稳定性及保护酶系统
• 1.3.3 活性氧的产生与清除
• 1.3.4 光合作用减弱
• 1.3.5 体内激素水平发生变化
• 1.3.6 逆境蛋白的合成
• 1.4 培育（耐）抗逆性作物的重要意义
• 1.5 甘蔗的遗传转化技术
• 1.5.1 农杆菌介导法及其特点
• 1.5.2 农杆菌介导法的转化机理
• 1.5.3 农杆菌介导法介导植物遗传转化技术在禾本科植物中的应用
• 1.6 甘蔗转基因的研究进展
• 1.6.1 甘蔗抗虫转基因研究
• 1.6.2 甘蔗抗菌转基因研究
• 1.6.3 甘蔗抗病毒转基因的研究
• 1.6.4 抗旱基因改良
• 1.6.5 甘蔗抗除草剂转基因研究
• 1.6.6 提高甘蔗蔗糖含量和改良蔗糖色泽的转基因研究
• 2 本研究的目的意义及内容
• 2.1 本研究的目的意义
• 2.2 本研究的内容
• 2.2.1 转（rbcS）1-SST基因甘蔗的检测
• 2.2.2 （pPST2a）1-SST基因的遗传转化及初步检测
• 3 材料
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 转（rbcS）1-SST基因甘蔗的供试材料
• 3.1.2 转化（pPST2a）1-SST基因的试验材料
• 3.2 试剂
• 3.2.1 检测转（rbcS）1-SST基因甘蔗的实验试剂及仪器
• 3.2.1.1 实验试剂
• 3.2.1.2 实验仪器
• 3.2.2 转（pPST2a）1-SST基因甘蔗检测的实验试剂及仪器
• 3.2.2.1 实验试剂
• 3.2.2.2 实验仪器
• 4 实验方法
• 4.1 转（rbcS）1-SST甘蔗的检测
• 4.1.1 转（rbcS）1-SST甘蔗转化植株的分子检测
• 4.1.1.1 田间植株的PCR验证
• 4.1.1.1.1 甘蔗总DNA的小量提取
• 4.1.1.1.2 转化植株目的基因的PCR重复验证
• 4.1.1.2 转（rbcS）1-SST基因甘蔗的RT-PCR检测
• 4.1.1.2.1 甘蔗总RNA的小量提取
• 4.1.1.2.2 反转录合成cDNA
• 4.1.1.2.3 actin以及目的基因片段的扩增
• 4.1.2 转（rbcS）1-SST基因甘蔗中目标产物的HPLC检测
• 4.1.2.1 色谱条件
• 4.1.2.2 标准样品配制
• 4.1.2.3 流动相的选择
• 4.1.2.4 样品处理
• 4.1.2.5 转（rbcS）1-SST基因甘蔗中可溶性糖的HPLC测定
• 4.1.2.6 精密度与回收率分析
• 4.1.2.6.1 精密度
• 4.1.2.6.2 回收率
• 4.1.3 田间生长生理指标的测定
• 2的测定'>4.1.3.1 净光合速率、蒸腾速率、气孔导度及胞间CO₂的测定
• 4.1.4 抗（耐）旱性试验及逆境相关生理指标的测定
• 4.1.4.1 抗（耐）旱材料处理
• 4.1.4.2 实验设施
• 4.1.4.3 耐抗旱实验设计及其相关生理指标的测定
• 4.1.4.3.1 干旱胁迫
• 4.1.4.3.2 逆境相关生理指标的测定
• 4.1.4.3.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 4.1.4.3.2.2 丙二醛（MDA）含量测定
• 4.1.4.3.2.3 脯氨酸（Pro）含量的测定
• 4.1.4.3.2.4 叶片叶绿素总量（Chl）的测定
• 4.1.4.3.2.5 株高及直径的测量
• 4.1.4.3.2.6 离体叶片保水率的测定
• 4.1.4.3.2.7 叶片质膜透性测定
• 4.1.5 转（rbcS）1-SST基因甘蔗的耐盐性试验
• 4.2 （pPST2a）1-SST基因的转化及抗性苗初步鉴定
• 4.2.1 （pPST2a）1-SST基因的转化
• 4.2.1.1 甘蔗转化材料及其农杆菌菌液的准备
• 4.2.1.1.1 几种主要的甘蔗培养基
• 4.2.1.1.2 甘蔗外植体的处理及愈伤组织的培养
• 4.2.1.1.3 农杆菌菌液的准备
• 4.2.1.1.4 愈伤组织的预处理
• 4.2.1.1.5 农杆菌侵染愈伤组织
• 4.2.1.1.6 共培养
• 4.2.1.1.7 农杆菌浸染后的愈伤组织分化成苗
• 4.2.1.1.8 甘蔗小植株的筛选培养
• 4.2.1.1.9 抗性苗的单株培养
• 4.2.1.1.10 抗性苗的生根培养及炼苗
• 4.2.2 抗性小苗的PCR检测
• 4.2.2.1 甘蔗小苗总DNA的小量提取
• 4.2.2.2 甘蔗抗性小苗的目的基因PCR检测
• 4.2.3 抗性小苗的初步逆境胁迫实验
• 4.2.3.1 抗性小苗的模拟干旱胁迫及盐胁迫实验
• 4.2.3.2 抗性小苗的干旱胁迫实验
• 5 结果与分析
• 5.1 转（rbcS）1-SST基因甘蔗转化植株的检测
• 5.1.1 转（rbsc）1一SST基因甘蔗转化植株的分子检测
• 5.1.1.1 转（rbcs）1一SST基因甘蔗转化植株的PCR检测
• 5.1.1.1.1 田间植株的DNA小量提取
• 5.1.1.1.2 PCR检测
• 5.1.1.2 转（rbcS）1-SST甘蔗基因转化植株的RT-PCR检测
• 5.1.1.2.1 RNA的小量提取
• 5.1.1.2.2 RT-PCR检测
• 5.1.2 转（rbcS）1-SST基因甘蔗中目标产物的HPLC检测
• 5.1.2.1 标准曲线的制作
• 5.1.2.2 样品分析
• 5.1.2.3 精密度与回收率
• 5.1.2.3.1 精密度
• 5.1.2.3.2 回收率
• 5.1.2.4 计算方法
• 5.1.3 转（rbcS）1-SST基因甘蔗的田间生长生理指标的测定
• 5.1.4 抗（耐）旱性试验及逆境相关生理指标
• 5.1.4.1 抗（耐）旱性试验
• 5.1.4.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 5.1.4.3 丙二醛（MDA）含量的测定
• 5.1.4.4 脯氨酸（Pro）含量的测定
• 5.1.4.5 干旱胁迫对甘蔗叶绿素总量（Chl）的影响
• 5.1.4.6 干旱对甘蔗生长的影响
• 5.1.4.7 离体叶片保水率测定
• 5.1.4.8 细胞质膜透性的测定
• 5.1.5 耐盐性试验
• 5.1.5.1 盐胁迫下叶绿素含量的测定
• 5.2 （pPST2a）1-SST基因的农杆菌介导法转化甘蔗优良品种及抗性苗初步鉴定
• 5.2.1 农杆菌介导的甘蔗遗传转化
• 5.2.2 转（pPST2a）1-SST基因的抗性苗的PCR检测
• 5.2.2.1 甘蔗幼苗总DNA小量提取
• 5.2.2.2 转（pPST2a）-SST基因的抗性甘蔗小苗的PCR检测
• 5.2.3 转（pPST2a）1-SST基因的甘蔗幼苗的模拟干旱及盐胁迫
• 5.2.3.1 转（pPST2a）1-SST基因的甘蔗幼苗的模拟干旱胁迫试验
• 5.2.3.2 转（pPST2a）1-SST基因的甘蔗幼苗的耐盐性试验
• 5.2.4 转（pPST2a）1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱胁迫实验
• 6 结论
• 6.1 转（rbcS）1-SST基因甘蔗的检测
• 6.2 （pPST2a）1-SST基因的转化及抗性苗抗逆性初步验证
• 7 讨论
• 7.1 关于1-SST基因
• 7.2 关于1-SST基因的表达产物
• 7.3 关于逆境指标的选择
• 8 本研究的后续工作
• 参考文献
• 9 缩写词
• 致谢