紫外线对虎杖愈伤组织中白藜芦醇合成诱导的研究

论文摘要

虎杖（Polygonum Cuspidatum Sieb et zucc）是蓼科萝属多年生草本植物,是常用的中药,主产地为华东、甘肃、四川、云南等地。虎杖提取物具有多种功能作用,主要有抗炎、预防心血管疾病等药理活性,而其主要活性成分则是白藜芦醇（resveratrol）和大黄素（emodin）。作为植保素的白藜芦醇,不仅能显著提高植物体对紫外线、真菌等伤害的抵御能力,还对心血管系统起着保护作用。本研究以虎杖的幼嫩茎段为外植体,以其诱导出的愈伤组织为材料,通过照射紫外线后暗培养处理、外加H202以及H202淬灭剂,研究了愈伤组织的生长和白藜芦醇含量的变化,并通过半定量RT-PCR扩增探讨了RS基因表达水平的状况。主要研究结果如下：1.不同紫外线照射和不同取样时间对虎杖愈伤组织中H2O2含量的影响经过不同时间紫外线照射后,暗培养愈伤组织,培养时间1-5h的愈伤组织H202的含量总体变化趋势是先增加后降低,H202的含量分别在第2h,4h出现高峰,所有处理的H202含量均高于CK,其中处理4的愈伤组织H202含量较高。在第2h时,处理4的峰值为2.68nmol·g-1,较CK提高了54%。在第4h时,处理4的峰值为2.84nmol·g-1,较CK提高了37%。暗培养时间4-20d的愈伤组织中H202的含量总体变化幅度不大,取样时间对H202含量影响不大。2不同时间紫外线照射和不同取样时间对愈伤组织形态和白藜芦醇（Res）含量影响不同时间紫外线照射对虎杖愈伤组织处理后,1-5小时内,愈伤组织无明显变化,颜色仍为嫩绿,形态蓬松。第四天起,随着时间的推移,愈伤组织出现老化,生长缓慢,比CK出现老化提前8天左右。而各处理的Res含量变化趋势是短时间内（1-5h）无规律的起伏变化,到达第4天后,Res含量明显的增高,并在第12天时到达高峰,处理3处理的Res含量较CK差异明显；处理后的第12d,各处理的Res的含量均下降。在整个Res含量变化趋势中,处理3的Res含量一直处于较高水平。3培养基中外加H2O2和H202淬灭剂对愈伤组织形态和Res含量的影响按照H202相对含量最高的愈伤组织中的H202含量比例,分别加入H202和H202淬灭剂于培养基中,继代愈伤组织于培养基上,接种后,1-5小时内,愈伤组织均无明显变化,而在第4天加入H2O2的愈伤组织已出现明显老化,而培养基中加入H2O2淬灭剂的愈伤组织继代后形态变化趋势和CK相似,在第4天未出现明显老化,到达12d后,愈伤组织出现老化。外加H202和H202淬灭剂的愈伤组织取样时间仍按照短时间（1-5h）和长时间（4-20d）来进行取样,取出的愈伤组织经过HPLC测定Res后,结果显示外加H202愈伤组织的Res含量1-5小时和第4天均略高于CK,而在4天后,Res含量明显低于CK,且在12d差异明显。加入H202淬灭剂的愈伤组织,1-5h内和CK的Res含量无太大差异,4-20d时Res含量略有增加,但明显低于CK。4.RS基因表达水平的检测将含白藜芦醇最高的愈伤组织,外加H202愈伤组织和对照组愈伤组织分别提取出RNA并进行电泳检测完整性,结果表明,3个样品的28S,18S,5.8S均显示清晰,表明提取的总RNA质量较好且比较完整,符合后续RT-PCR扩增的实验要求。将提取所得RNA进行半定量RT-PCR扩增,反应结束后,取1.2μ1的产物,以添加Rnase清除剂的TAE为缓冲液,90V/cm电泳20min后,于紫外灯下观察拍照。三个样均在600bp左右扩增出内参照基因actin,且亮度和宽度无差异,表明内参照基因稳定表达,利用特异性引物,Res含量最高组在1000bp上方扩增到期望的1200bp左右的特异性片段A,而对照组和外加H202组未扩增到该片段,说明经过紫外线照射后,RS基因表达水平得到了提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1.1 虎杖概况
• 1.2 白藜芦醇的性质及其合成途径
• 1.2.1 白藜芦醇的生物特性
• 1.2.2 白藜芦醇的合成
• 1.3 白藜芦醇合成酶的性质
• 1.4 白藜芦醇诱导途径的研究
• 1.4.1 生物诱导途径研究
• 1.4.2 非生物途径诱导研究状况
• 1.5 紫外线诱导在其他研究中的应用状况
• 1.6 植物组织培养辅助诱导
• 1.7 活性氧的研究概况
• 1.8 白藜芦醇合成酶的基因方面的研究
• 1.9 RT-PCR检测基因表达水平的研究状况
• 1.10 研究方式与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 虎杖愈伤组织的培养
• 2.3 愈伤组织的诱导处理
• 2.4 不同取样时间
• 2O₂的测定'>2.5 愈伤组织中H₂O₂的测定
• 2O₂和H₂O₂淬灭剂'>2.6 培养基中添加H₂O₂和H₂O₂淬灭剂
• 2O₂的添加'>2.6.1 培养基中H₂O₂的添加
• 2O₂淬灭剂的添加'>2.6.2 培养基中H₂O₂淬灭剂的添加
• 2.7 虎杖愈伤组织形态变化的观察
• 2.8 愈伤组织中白藜芦醇的提取及测定
• 2.9 白藜芦醇线性关系的确定
• 2.10 RNA的提取及纯度检验
• 2.11 一步法RT-PCR扩增
• 2.12 电泳结果处理
• 3. 结果分析
• 2O₂含量及其形态变化的影响'>3.1 不同时间紫外线照射对虎杖愈伤组织H₂O₂含量及其形态变化的影响
• 2O₂含量的变化'>3.1.1 短时间取样组中愈伤组织H₂O₂含量的变化
• 2O₂含量变化'>3.1.2 长时间取样组中愈伤组织H₂O₂含量变化
• 2O₂含量的影响'>3.1.3 不同时间紫外线照射对虎杖愈伤组织H₂O₂含量的影响
• 3.1.4 不同时间紫外线照射后愈伤组织形态变化
• 3.2 不同时间紫外线照射和不同取样时间对虎杖愈伤组织中RES含量影响
• 2O₂组中愈伤组织中RES含量的变化'>3.3 外加H₂O₂组中愈伤组织中RES含量的变化
• 2O₂淬灭剂的愈伤组织中RES含量的变化'>3.4 外加H₂O₂淬灭剂的愈伤组织中RES含量的变化
• 2O₂和H₂O₂淬灭剂后愈伤组织形态的变化'>3.5 分别添加H₂O₂和H₂O₂淬灭剂后愈伤组织形态的变化
• 2O₂含量变化与RES含量变化之间关系'>3.6 紫外线照射后愈伤组织中H₂O₂含量变化与RES含量变化之间关系
• 3.7 RS基因表达水平的分子水平检测
• 3.7.1 愈伤组织总RNA提取结果
• 3.7.2 RT-PCR检测结果
• 4 讨论
• 2O₂含量的影响'>4.1 不同时间紫外线照射对H₂O₂含量的影响
• 4.2 不同时间紫外线照射对RES含量的影响
• 2O₂和RES含量变化的影响'>4.3 不同取样时间对H₂O₂和RES含量变化的影响
• 2O₂含量变化对白藜芦醇含量变化的影响'>4.4 H₂O₂含量变化对白藜芦醇含量变化的影响
• 2O₂、H₂O₂淬灭剂与虎杖愈伤组织中RES含量的关系'>4.5 外加H₂O₂、H₂O₂淬灭剂与虎杖愈伤组织中RES含量的关系
• 4.6 RS基因表达水平的RT-PCR检测
• 5.结论
• 5.1 紫外线诱导虎杖愈伤组织
• 5.2 从分子水平上来探讨白藜芦醇合成酶在紫外线诱导后的表达
• 参考文献
• 附图
• 致谢