腺相关病毒介导的人护骨素对炎症性关节破坏的保护作用

论文摘要

研究背景:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种系统性自身免疫病,以进行性关节软骨和骨破坏为主要特征。大量研究表明破骨细胞（Osteoclast,OC）在RA的关节破坏中发挥关键作用,在RA滑膜炎阶段可以观察到增生的滑膜或血管翳由骨软骨移行部向骨组织侵蚀的征象,在其最前线有大量的抗酒石酸酸性磷酸酶和降钙素受体阳性的多核细胞即OC的存在。NF-kB受体活化因子配体（Receptor activator ofNF-kB ligand,RANKL）也称OC分化因子,与破骨前体细胞或OC表面上的受体RANK结合,可激活转录因子NF-kB和蛋白激酶JNK,从而促进OC的增殖、分化、成熟和骨吸收活性。护骨素（Osteoprotegerin,OPG）属于TNF受体超家族成员,是RANKL的诱骗（decoy）受体即天然拮抗剂,可阻断RANKL与RANK的结合,从而抑制RANKL的生物学作用。正常骨重建和病理性骨病的发生均受RANKL与OPG平衡的控制,各种上游因子如1,25（OH）2D3、甲状旁腺激素、前列腺素、TNFα、IL-1β、IL-6等最终均通过改变RANKL/OPG的比率而发挥作用。RANKL起破骨作用,而OPG对骨丢失有保护作用。目前研究不仅证实OC及其RANKL/RANK系统参与RA骨关节破坏,而且提示外源性增加OPG对RA关节破坏具有潜在的治疗价值。最新的OPG-Fc融合蛋白对RA的关节破坏具有明显的治疗作用,但存在半衰期短,产生抗体等不足,需要多次注射,价格昂贵,且可产生OPG抗体,影响治疗效果。因此探索RA的新治疗仍是研究热点。基因治疗通过诱导相关基因表达,从而体内产生治疗蛋白,提高有效性和表达的长期性,可避开这些弊端。腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）是属于细小病毒组的DNA病毒,对人类没有致病性。它能有效感染多种细胞,包括分裂期和静息期细胞。转染后的细胞无体内免疫反应,转基因的长期表达以及病毒粒子的稳定性使其成为最有吸引力的转基因工具之一。本实验构建了表达人OPG的复制缺陷性腺相关病毒,在体外实验中已证实其具有抑制破骨细胞分化和骨吸收的活性。通过对胶原诱导性关节炎大鼠膝关节腔注射rAAV-hOPG来观察OPG对关节骨质破坏的保护作用。第一部分携带人护骨素的重组腺相关病毒（rAAV2-hOPG）的构建及滴度测定目的:构建携带人护骨素的重组腺相关病毒,并检测其滴度。方法:采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到含AAV2反向末端序列的载体质粒pSNAV上,构建重组pSNAV2.0-hOPG质粒,并用PCR、酶切和测序鉴定,利用Lipofectamine 2000系统在BHK-21细胞内进行G418选择培养,辅助病毒HSV-rc/△UL2感染后用转瓶进行大规模制备,采用“氯仿处理-PEG/Nacl沉淀氯仿抽提”3个步骤分离,浓缩和纯化rAAV,从而制备高滴度、高纯度的腺相关病毒颗粒。结果:酶切鉴定、PCR以及测序结果均证明hOPG基因重组腺相关病毒载体构建成功,病毒滴度可达4×1011vg/ml。结论:成功制备了高滴度的hOPG基因重组腺相关病毒2。第二部分腺相关病毒介导的人护骨素基因对胶原诱导性关节炎大鼠关节破坏的保护作用目的:研究rAAV-OPG对胶原诱导性关节炎大鼠关节破坏的影响。方法:经牛Ⅱ型胶原诱导建立大鼠关节炎模型,随机分成4组:正常对照组,CIA空白对照组,EGFP阴性对照组,OPG治疗组,每组10只,于关节炎明显时开始,分别予PBS、PBS、rAAV-EGFP、rAAV-hOPG双膝关节腔内注射50ul/侧。观察比较四组大鼠体重,掌跖厚度,关节炎指数,病理评分,X线放射学评分,骨破坏因子及炎症因子表达。结果:预实验确定注射病毒载体的最佳转染浓度,冰冻切片证实AAV能有效转导关节滑膜及骨髓等组织,RealTime-PCR证实病毒感染后,OPG基因转录水平增高128.21%,TRAP表达下降了58.79%,对VEGF表达无明显影响。ELISA证实OPG蛋白的表达水平升高93.41%,骨破坏评分下降30.18%,结论:rAAV-hOPG能有效转导关节组织,显著减轻炎性关节炎的骨质破坏,可能对关节软骨有一定保护作用,对关节炎症无明显影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要英文缩略词表
• 第一部分 rAAV2-hOPG的构建及滴度测定
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 三、实验结果
• 四、讨论
• 第二部分 rAAV-hOPG对胶原诱导性关节炎大鼠关节破坏的保护作用
• 一、前言
• 二、材料
• 三、方法
• 四、结果
• 五、讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢
• 附页