草鱼四个候选内参基因稳定性比较及两个免疫相关基因的克隆与表达研究

论文摘要

草鱼是大型鲤科经济鱼类,为我国四大家鱼之一,也是我国养殖产量最高的鱼类。然而,由呼肠孤病毒引起的草鱼出血病是危害草鱼最为严重的病毒性疾病,给养殖者造成重大的经济损失。本试验以草鱼为研究对象,利用分子生物学方法,在基因水平上研究了草鱼先天性免疫相关基因,为探索草鱼抗病机制以及抗病育种提供分子生物学依据。论文由三部分组成:第一部分主要探讨了常用内参基因在草鱼分子生物学试验过程中的表达稳定性,为研究草鱼免疫基因提供内参依据;第二部分克隆了草鱼先天性免疫途径中重要的接头分子髓样分化因子88（myeloid differentiation protein 88, MyD88）,并研究了该基因在不同组织和感染后脾脏组织中不同时间点的表达情况。第三部分克隆了草鱼Toll样受体9（Toll-like receptor 9, TLR9） cDNA片段,并研究了TLR9在草鱼不同组织中的表达差异性。1.草鱼4个候选内参基因表达稳定性的研究实时定量RT-PCR是检测细胞和组织中mRNA表达常用的技术,已经在水产生物技术中大量应用,而选择合适的内参基因对准确进行目的基因表达水平的定量研究具有重要的意义。本试验首先克隆草鱼EF1-α基因的部分序列,然后通过实时定量RT-PCR方法研究了四种常用内参基因（18S rRNA、β-actin、GAPDH、EF1-α）在草鱼不同组织中的表达丰度,其中18S rRNA的表达丰度最高（Ct值为17.17±0.24）;GAPDH的表达量最低（Ct值为28.95±0.85）。利用geNorm、NormFinder和BestKeepe软件对候选内参进行排序,内参基因表达稳定性为:18S rRNA>EF1-α>GAPDH>β-actin;因此,研究草鱼不同组织基因表达,推荐使用18S rRNA和EF1-α为内参基因。草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus, GCRV）感染不同时期草鱼脾脏中候选内参基因表达稳定性研究显示了18S rRNA的表达丰度最高（Ct值为14.49±0.27）;GAPDH的表达量最低（Ct值为24.82±0.22）;利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参进行排序,内参基因表达稳定性为:18S rRNA>β-actin>GAPDH>EF1-α;因此,研究病毒刺激后草鱼基因表达情况,我们推荐使用18S rRNA和β-actin为内参基因。18S rRNA在草鱼不同组织和病毒刺激下脾脏组织中的表达稳定性都为最高。2.接头分子MyD88基因的克隆与表达研究采用同源克隆与快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA ends, RACE）技术,从草鱼中克隆了TLR信号通路中重要的接头分子MyD88。cDNA全长为1204nt,其中5’UTR为249nt,3’UTR为99bp,开放阅读框（ORF）为855bp,编码284个氨基酸残基。SMART软件预测草鱼MyD88含有1个DEATH结构域和一个TIR结构域。对序列比对后发现草鱼MyD88同其他鱼类以及哺乳动物有高度的相似性,并都具有三个保守的区域:Box1（FDAFICYCQ）,Box2（RDVLPG）和Box3（FWTRLA）,说明了MyD88基因在进化过程中存在高度的保守性。采用RT-PCR检测了该基因在皮肤,脾脏,肝脏,心脏,头肾,中肾,肌肉,肠道,9种组织的表达,结果显示:草鱼MyD88在被测组织中广泛地表达,在脾脏中的表达丰度最高。在GCRV感染过程中,用实时定量RT-PCR技术检测了草鱼脾脏组织中MyD88基因的表达规律。肝脏组织中MyD88的表达较对照组都有明显的上调（P<0.05）,并呈逐渐上升的趋势。而在72h时间点,MyD88的表达量出现了下降,120h表达量又开始上升,并达到最高点。在脾脏组织中,感染早期MyD88也出现明显的上调,并在24h时达到顶峰,随后从24h到72h表达量逐渐下降,在72h回到对照组水平,最后又有上调的趋势（120h,P<0.05）。3.草鱼TLR9基因部分序列的克隆及组织差异性表达研究采用同源克隆与RACE技术,获得了草鱼TLR9片段以及3’末端序列,草鱼TLR9基因在健康草鱼肌肉、皮肤、肝脏、头肾、中肾、鳃、肠道、心脏组织表达丰度均较低,在脾脏组织中表达量相对较高。通过比较草鱼四种常用内参基因的表达稳定性,我们发现18S rRNA的稳定性最好,并推荐作为内参基因来研究草鱼免疫相关基因的表达。通过草鱼MyD88和TLR9基因的克隆和表达研究,发现MyD88具有一定的保守性,并且参与了草鱼的抗病毒免疫应答;草鱼TLR9基因片段克隆和组织差异性表达研究显示了,TLR9在草鱼不同组织中的表达丰度较低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 草鱼出血病
• 1.1.1 病原
• 1.1.2 症状和病理变化
• 1.1.3 诊断方法
• 1.1.4 流行情况
• 1.1.5 防治方法
• 1.2 基因表达研究中内参基因的选择
• 1.2.1 实时定量RT-PCR（quantitative real-time RT-PCR）
• 1.2.2 内参基因的选择以及在水产动物中的研究进展
• 1.3 Toll 样受体及其信号传导中的接头分子研究进展
• 1.3.1 硬骨鱼类先天性免疫概述
• 1.3.2 Toll 样受体及其接头蛋白MyD88 研究进展
• 1.4 本试验开展的目的和意义
• 1.4.1 为研究草鱼不同组织以及病毒刺激条件下的基因表达提供合适的内参
• 1.4.2 为鱼类抗病育种提供一些分子生物学基础
• 第二章 草鱼四种候选内参基因的稳定性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要试验仪器和试剂
• 2.1.3 RNA 提取和cDNA 模板第一链的合成
• 2.1.4 草鱼EF1-α基因的克隆以及候选内参基因实时定量PCR 引物设计
• 2.1.5 实时定量PCR
• 2.1.6 数据分析
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 草鱼呼肠孤病毒GCRV 攻毒试验以及病毒检测
• 2.2.2 草鱼总RNA 提取
• 2.2.3 RT-PCR 检测病鱼组织中的GCRV 病毒
• 2.2.4 草鱼EF1-α基因片段的克隆与鉴定
• 2.2.5 草鱼候选内参基因引物检测
• 2.2.6 实时定量PCR 的扩增效率
• 2.2.7 草鱼不同组织中候选内参基因表达稳定性
• 2.2.8 呼肠孤病毒感染不同时期草鱼脾脏中候选内参基因表达稳定性研究
• 2.3 讨论
• 第三章 草鱼髓样分化因子88 基因的克隆与表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验动物
• 3.1.2 试验材料
• 3.1.3 草鱼RNA 提取与cDNA 第一链的合成
• 3.1.4 PCR 扩增片段TA 克隆以及菌液测序
• 3.1.5 采用同源克隆方法以及RACE 法克隆草鱼MyD88 cDNA 全长
• 3.1.6 草鱼MyD88 基因的生物信息学分析
• 3.1.7 半定量RT-PCR 法检测目的基因的组织差异性表达
• 3.1.8 实时定量PCR 法检测目的基因的表达
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 草鱼MyD88 cDNA 全长克隆
• 3.2.2 草鱼MyD88 基因的生物信息学分析
• 3.2.3 草鱼MyD88 基因在不同组织中差异性表达
• 3.2.4 实时定量PCR 检测MyD88 基因在草鱼脾脏组织中的时序表达
• 3.3 讨论
• 第四章 草鱼TLR9 基因的克隆以及组织差异性表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验动物
• 4.1.2 试验材料
• 4.1.3 草鱼RNA 提取与cDNA 第一链的合成
• 4.1.4 扩增片段TA 克隆以及菌液测序
• 4.1.5 草鱼TLR9 基因克隆
• 4.1.6 草鱼TLR9 基因在不同组织中差异性表达
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 草鱼TLR9 片段的扩增
• 4.2.2 草鱼TLR9 片段的同源性比对分析
• 4.2.3 半定量RT-PCR 检测草鱼TLR9 的表达
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 5.1 草鱼内参基因比较研究
• 5.2 草鱼髓样分化因子88 基因研究
• 5.3 草鱼Toll 样受体9 基因研究
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介