论文摘要
鼠伤寒沙门菌属于肠杆菌科,是重要的肠道致病菌,致病谱从自限性的胃肠炎到危及生命的全身性系统疾病。沙门菌是兼性细胞内寄生菌,在感染致病过程中侵入许多吞噬和非吞噬细胞并在宿主细胞内寄生存活。巨噬细胞是鼠伤寒沙门菌感染的重要宿主,在疾病的发展及转归中起重要作用。感染鼠伤寒沙门菌的宿主细胞启动诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）系统产生一氧化氮（nitric oxide, NO）及活性氮化合物（reactive nitrogen species,RNS）抑制和杀灭细胞内沙门菌。iNOS在不同细胞可定位于胞浆、囊泡和过氧化物酶体。本研究中,使用活的和灭活的鼠伤寒沙门菌（ATCC 14028）感染鼠巨噬细胞（RAW264.7）和昆明小鼠。研究感染过程中巨噬细胞iNOS、过氧化物酶体膜表面蛋白70（The 70-kDa Peroxisomal Membrane Protein,PMP70）的表达和细胞内鼠伤寒沙门菌数量的关系;使用iNOS选择性抑制剂1400W（N-（3-[Aminomethyl]benzyl）acetamidine）预处理巨噬细胞,检测活菌感染细胞的培养液NO浓度、计数细胞内细菌数量;检测感染昆明小鼠血浆和肝脏NO浓度。对比以上检测活菌和灭活菌间的差异,及随感染时间变化的差异,探讨鼠伤寒沙门菌感染的特点;对比使用和未使用1400W处理感染细胞的结果,探讨iNOS在沙门菌感染中的作用。研究感染巨噬细胞内iNOS、过氧化物酶体和沙门菌三者之间的定位关系,探讨过氧化物酶体的抗菌功能,为沙门菌感染的治疗提供依据。一、鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞诱导iNOS表达的检测用活的和灭活的鼠伤寒沙门菌以细菌:细胞比为20:1,即感染复数（Multiplicity of Infection,MOI）为20,感染RAW264.7 1h,用PBS洗掉细胞外游离细菌并继续培养到指定时间（1h、4h、8h、12h、24h）做以下检测。提取活菌和灭活菌两感染组各感染时间的细胞总RNA,用随机引物逆转录cDNA做实时定量PCR（Real-time PCR）以GAPDH为参比基因检测目的基因iNOS。用Griess试剂测定两感染组各感染时间的细胞培养液NO浓度。结果显示两感染组均在感染的前12h iNOS mRNA表达呈持续升高。在12h达最高值,活菌感染和灭活菌感染分别为未感染对照的21.723倍和22.051倍,两数据间比较无明显差异。而在1h、4h、8h、24h时灭活菌感染细胞iNOS mRNA的表达均显著高于活菌感染细胞的表达。两感染组细胞培养液NO浓度同样在感染的前12h表达呈持续升高,在12h达最高值后下降。在相同的各指定时间点活菌感染的细胞上清NO浓度均显著低于灭活菌感染组。总之活菌感染和灭活菌感染均能显著诱导RAW264.7 iNOS mRNA的表达和NO浓度的升高,但灭活菌比活菌诱导能力更强。这些结果说明鼠伤寒沙门菌感染能显著诱导巨噬细胞iNOS的表达。结合感染细胞内细菌计数结果表明,活菌对iNOSmRNA的表达和NO的生成有抑制作用。二、鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞内细菌计数用活菌和灭活的鼠伤寒沙门菌以MOI=20感染RAW264.7 1h,用PBS洗掉细胞外游离细菌并继续培养到指定时间（1h、4h、8h、12h、24h）。取活菌和灭活菌感染各时间的细胞爬片,用4%多聚甲醛固定,做免疫荧光标记细胞内沙门菌,在荧光显微镜下观察计数细胞内细菌。收集活菌感染各时间点的细胞,用0.1%Triton X-100 PBS裂解细胞。取裂解液用LB平板做细菌培养,计数平板的菌落数,计算细胞内的活菌数。对细菌计数结果进行统计学分析,结果显示活菌感染的免疫荧光染色细菌计数和裂解细胞细菌计数间差异显著,结合两种计数方法的特点,差异为细胞内部分活菌被细胞杀灭。活菌感染的免疫荧光计数和裂解细胞活菌计数显示,在前12h内细菌数量逐渐增多,在12h达最大值。1h、4h、8h两计数方法结果间差异无统计学意义;在12h和24h两计数结果间差异显著,有统计学意义。在24h免疫荧光细菌计数为13.857个/细菌为裂解细胞活菌计数7.940个/细菌的1.744倍,有显著差异,即此时细胞内细菌部分被杀灭。灭活菌感染细胞内细菌计数在不同时间点计数间差异显著,即细菌因被细胞降解而减少。结合感染细胞的荧光显微镜图片,灭活菌被细胞降解逐渐变小成细颗粒。以上结果结合iNOS表达的结果说明活的鼠伤寒沙门菌在巨噬细胞内增殖,诱导细胞iNOS表达,生成杀菌物质NO,浓度达到一定水平细菌被杀灭,灭活的细菌被细胞降解。三、1400W预处理巨噬细胞感染各时间点细胞培养液NO浓度和细胞内沙门菌计数将巨噬细胞接种在6孔板,使用1400W终浓度为50umol/L的10%DMEM预处理24h。然后以MOI=20用鼠伤寒沙门菌活菌感染巨噬细胞1h,用PBS洗掉细胞外游离细菌并继续培养到指定时间（1h、4h、8h、12h、24h）,在培养细胞整个过程中均使用1400W终浓度为50umol/L的10%DMEM。使用Griess试剂检测感染各时间点培养液的NO浓度。通过免疫荧光染色沙门菌和使用0.1%Triton X-100 PBS裂解细胞做细菌培养计数细胞内细菌。结果显示1400W处理细胞未感染及感染各时间点细胞培养液NO浓度差异无统计学意义,其NO浓度显著低于未使用1400W处理的感染细胞培养液NO浓度,即感染细菌诱导的iNOS活性被1400W完全抑制。1400W处理后各感染时间的感染细胞内细菌的两种方法计数结果均比未使用1400W处理感染细胞内细菌的相同方法细菌计数明显增多。1400W处理的感染细胞免疫荧光染色细胞内细菌计数和裂解细胞存活菌计数间差异无统计学意义。以上结果说明,使用1400W抑制iNOS活性,杀菌物质NO生成显著减少,在低浓度NO时细胞内细菌增殖和存活均显著高于未使用1400W处理的感染细胞。四、昆明小鼠感染鼠伤寒沙门菌期间血浆和肝脏NO浓度的检测用活菌和灭活的鼠伤寒沙门菌以1.75×107个/只,腹腔接种感染昆明小鼠。分别在感染后1h、4h、8h、12h、24h取血分离血浆,断颈处死小鼠解剖取肝脏,检测血浆和肝组织的NO浓度。结果显示活菌比灭活菌感染能显著引起小鼠血浆和肝组织NO浓度升高。活菌感染的昆明小鼠血浆NO浓度在1h时即明显升高,随后逐渐升高在12h达最高值,为未感染组的5.823倍;肝组织NO浓度在感染后升高,在8h～12h持续处于高水平。灭活菌感染的昆明小鼠血浆和肝组织NO浓度升高变化平缓。相同时间点活菌和灭活菌感染小鼠的血浆NO浓度均有显著差异;相同时间点活菌和灭活菌感染小鼠的肝组织NO浓度在1h时无显著差异,其他时间点有显著差异。这些结果说明活菌比灭活菌感染更易引起小鼠血浆和肝脏生成NO,沙门菌感染至肝脏时诱导肝细胞NO生成。五、鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞诱导PMP70 mRNA表达的检测提取活菌和灭活菌以MOI=20感染RAW264.7细胞1h并培养到指定各时间点（1h、4h、8h、12h、24h）,提取细胞总RNA,用随机引物逆转录cDNA,做实时定量PCR,以GAPDH为参比基因检测目的基因PMP70。结果显示,活菌感染各时间点PMP70 mRNA的表达差异显著,有统计学意义;灭活菌感染各时间点PMP70 mRNA的表达差异无统计学意义。活菌和灭活菌对PMP70 mRNA表达的诱导存在显著差异。活菌感染组PMP70 mRNA表达随时间升高后降低在8h达最高值为对照的2.307倍,8h、12h和24h均显著高于对照组和相同时间点的灭活菌感染组。结果说明活菌比灭活菌感染更能有效诱导PMP70 mRNA的表达。六、感染巨噬细胞内iNOS、过氧化物酶体和鼠伤寒沙门菌的定位关系的研究用鼠伤寒沙门菌以MOI=20感染鼠巨噬细胞1h并培养到12h。做免疫荧光两两标记iNOS、过氧化物酶体、鼠伤寒沙门菌,通过共聚焦荧光显微镜观察三者在细胞内的定位关系。用鼠伤寒沙门菌以MOI=20感染鼠巨噬细胞1h并培养到12h,用免疫胶体金标记过氧化物酶体,通过透射电镜观察过氧化物酶体与鼠伤寒沙门菌的定位关系。免疫荧光结果显示在感染的巨噬细胞内iNOS、过氧化物酶体、鼠伤寒沙门菌存在两两的共定位关系。电镜结果显示标记金颗粒的过氧化物酶体和含沙门菌囊泡紧靠在一起。结果说明感染巨噬细胞内iNOS定位于过氧化物酶体参与细胞内沙门菌的杀灭。本课题实验结果表明,鼠伤寒沙门菌的感染能有效诱导宿主细胞iNOS mRNA的表达和杀菌物质NO的生成,杀菌物质达到一定水平时,感染细胞内部分沙门菌被杀灭。活菌感染对巨噬细胞iNOS的表达有抑制作用。1400W选择性抑制iNOS活性后,感染细胞的杀菌物质NO生成显著减少,沙门菌在细胞内存活和增殖均显著增高。活菌感染能显著诱导巨噬PMP70 mRNA的表达。活菌感染巨噬细胞内iNOS和过氧化物酶体存在共定位,两者均与沙门菌存在共定位。因此推断,鼠伤寒沙门菌活菌感染显著诱导iNOS的表达,定位在过氧化物酶体的iNOS具有杀菌功能。本课题首次提出过氧化物酶体的杀菌功能,为沙门菌感染的治疗提供理论依据。