鸡源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白（MOMP）基因重组腺病毒活载体疫苗研究

论文摘要

本研究分离了鸡源鹦鹉热衣原体,建立了鸡衣原体病PCR诊断方法。利用E1和E3缺失的人腺病毒5型载体,首次在国内外成功构建了含有鸡源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白（MOMP）基因的重组腺病毒。并用重组腺病毒对本动物鸡进行了免疫试验和安全试验。 （1） 从疑似患鹦鹉热衣原体病鸡分离到衣原体,经涂片观察、接种鸡胚,碘染色试验、磺胺嘧啶钠试验、电子显微镜观察,确定为鹦鹉热衣原体,命名为hnq株,用鸡胚法测定其毒力为1.8×10-7/0.2ELD50,CpL株的毒力为5.6×1010/0.2 ELD50。选择CpL株为研究对象。建立了鸡源鹦鹉热衣原体PCR诊断方法,并对其特异性、敏感性和灵敏度进行了验证。 （2） 对鸡源鹦鹉热衣原体CpL株MOMP基因进行了克隆和测序,并与禽源鹦鹉热衣原体其他菌株的MOMP基因进行了序列比较。结果表明,与禽源衣原体鸭（GD）株的MOMP氨基酸序列同源性为89.7%;与火鸡（CT1）株MOMP氨基酸序列同源性为88.7%;与鸽子（CP3）株MOMP氨基酸序列同源性为82.3%;与长尾小鹦鹉（VS225）株的MOMP氨基酸序列同源性为94.4%。 （3） 通过基因操作的方法,将鸡源鹦鹉热衣原体CpL株MOMP基因置于腺病毒穿梭载体的巨细胞瘤（CMV）启动子和SV40 Poly（A）尾巴之间,构建成目的基因的表达盒。构建的穿梭载体与腺病毒骨架载体在BJ5183工程菌内进行同源重组,筛选阳性重组腺病毒质粒,命名为Ad-MOMP。序列测定表明,Ad-MOMP重组腺病毒所带的鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因的氨基酸序列完全正确。转染HEK293细胞,用间接免疫荧光对表达产物检测,证明所构建的重组腺病毒能正确表达目的基因。减蛋综合征(EDS76)阳性血清中和试验表明,不能中和重组腺病毒。重组腺病毒稳定性试验表明,该重组病毒能稳定携带外源基因进行传代（23代）。 （4） 禽源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒免疫SPF小鸡,第21天测定抗MOMP抗体,达到1:32,用6.8×109TCID50免疫SPF小鸡。能够抵抗5.6×1010ELD50同源强毒CpL株的攻击获得保护,保护率达9/10;用减蛋综合征病毒(EDS76V)检测重组腺病毒抗体,表明二者无抗原—抗体交叉反应。用野生型腺病毒和HEK293细胞免疫的对照组均未产生任何的免疫保护效果。肌肉与皮下两种免疫途径试验结果表明,二者基本无差别,考虑到田间免疫的实用性,选择肌肉免疫。 （5）根据SPF小鸡免疫攻毒试验结果,用6.8×109TCID50重组腺病毒一次肌肉免疫7日龄小鸡,21天后用同源强毒CpL株进行攻击,观察结果6个月,表明免疫小鸡能够抵抗1.1×1010ELD50鹦鹉热衣原体强毒的攻击,保护率达8/10。对照组10只鸡剖检后全部表现出鹦鹉热衣原体症状。抗体持续期试验表明,免疫后21天抗体水平达到最高（1:64）,随后开始逐渐下降,至180天时,抗体水平仍然维持在保护水平。应用衣原体IHA和四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测了小鸡的体液免疫和细胞免疫,表明二者都有应答。重组腺病毒安全性试验表明,小鸡生长正常,无排毒现象。重组腺病毒保存期试验显示,-20℃保存1年后 该重组腺病毒滴度有所下降,但不影响免疫力。

论文目录

• 第一章 绪言
• 1.1 衣原体概述
• 1.2 衣原体分类
• 1.3 禽衣原体病
• 1.4 我国动物衣原体病流行情况
• 1.4.1 流行情况
• 1.5 衣原体分子生物学结构与功能
• 1.5.1 基因组研究进展
• 1.5.2 蛋白组学研究进展
• 1.6 鹦鹉热衣原体疫苗研究进展
• 1.6.1 减毒活疫苗
• 1.6.2 灭活疫苗
• 1.6.3 基因工程疫苗
• 1.6.4 结语
• 1.7 腺病毒载体的应用
• 1.7.1 腺病毒概况
• 1.7.2 腺病毒载体在疫苗研究中的应用
• 1.8 我国动物衣原体病研究概况
• 第二章 鸡源鹦鹉热衣原体分离与鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 鸡胚、实验动物及试剂
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 血清学检查
• 2.2.2 病原分离鉴定
• 2.3 讨论
• 第三章 鸡衣原体病PCR诊断方法的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种、仪器及试剂
• 3.1.2 引物
• 3.2 方法
• 3.2.1 鸡衣原体基因组DNA的提取
• 3.2.2 PCR反应体系及条件
• 3.2.3 PCR产物的观察
• 3.2.4 减蛋综合症病毒（EDS76V）DNA、新城疫病毒（NDV）RNA、传染性支气管炎病毒（IBV）的RT-PCR
• 3.2.5 鸡衣原体MOMP蛋白基因引物特异性检测
• 3.2.6 鸡衣原体PCR灵敏度的检测
• 3.2.7 鸡衣原体病PCR诊断与间接血凝（IHA）试验敏感性的比较
• 3.2.8 鸡源鹦鹉热衣原体病PCR诊断稳定性试验
• 3.3 结果
• 3.3.1 套式PCR反应结果
• 3.3.2 PCR反应特异性试验结果
• 3.3.3 灵敏度试验
• 3.3.4 鸡衣原体病PCR诊断与间接血凝（IHA）试验敏感性的比较
• 3.3.5 鸡衣原体病PCR诊断方法稳定性试验
• 3.4.讨论
• 第四章 鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因的克隆与序列分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 鸡源鹦鹉热衣原体（CpL株）MOMP基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳
• 4.1.3 PCR产物回收
• 4.1.4 回收的PCR产物与pMD-18T载体的连接与转化
• 4.1.5 质粒DNA的提取
• 4.1.6 重组质粒酶切鉴定
• 4.1.7 重组质粒PCR鉴定
• 4.1.8 序列测定
• 4.1.9 序列同源性分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组质粒酶切鉴定
• 4.2.2 重组质粒PCR鉴定
• 4.2.3 序列同源性比较
• 4.3 讨论
• 第五章 鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒载体的构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 质粒载体与宿主菌
• 5.1.2 引物
• 5.1.3 MOMP基因的PCR扩增
• 5.1.4 MOMP片段与pMD18-simple T载体的连接
• 5.1.5 MOMP基因片段插入穿梭载体
• 5.1.6 BJ5183感受态细胞的制备
• 5.1.7 细菌内同源重组
• 5.2 结果
• 5.2.1 MOMP／pMD18-simple-T重组质粒PCR鉴定
• 5.2.2 MOMP／pMD18-simple-T重组质粒酶切鉴定
• 5.2.3 重组穿梭质粒酶切鉴定和PCR鉴定
• 5.2.4 重组穿梭质粒序列测定
• 5.2.5 重组腺病毒质粒PCR鉴定和酶切鉴定
• 5.3 讨论
• 第六章 鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒质粒转染与鉴定
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 细胞、菌株和试剂
• 6.1.2 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞
• 6.1.3 重组腺病毒的培养
• 6.1.4 PCR检测目的基因
• 6.1.5 间接免疫荧光检测目的基因的表达
• 6.1.6 重组腺病毒与减蛋综合征阳性血清的中和试验
• 6.1.7 重组腺病毒稳定性试验
• 6.1.8 有限稀释法测定重组腺病毒毒价
• 6.1.9 重组腺病毒噬斑试验测定毒价
• 6.1.10 重组腺病毒电镜观察
• 6.2 结果
• 6.2.1 重组腺病毒转染HEK293细胞
• 6.2.2 PCR检测MOMP基因
• 6.2.3 间接免疫荧光检测MOMP基因的表达
• 6.2.4 重组腺病毒减蛋综合征阳性血清中和试验
• 6.2.5 重组腺病毒稳定性检测
• 6.2.6 重组腺病毒毒价测定
• 6.2.7 重组腺病毒噬斑试验测定毒价
• 6.2.8 重组腺病毒电镜观察
• 6.3 讨论
• 第七章 鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒的SPF雏鸡免疫试验
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 细胞和培养基
• 7.1.2 重组腺病毒制备
• 7.1.3 CpL鸡胚适应毒
• 7.1.4 试验动物及分组
• 7.1.5 血清抗体效价测定
• 7.1.6 重组腺病毒血清抗体检测
• 7.1.7 攻毒保护试验
• 7.2 结果
• 7.2.1 免疫前的鹦鹉热衣原体抗体水平
• 7.2.2 免疫后血清抗体的测定
• 7.2.3 肌肉免疫和皮下免疫抗体水平比较
• 7.2.4 重组腺病毒血清抗体的测定
• 7.2.5 攻毒保护试验结果
• 7.3 讨论
• 第八章 鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒本动物试验及生物学评价
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 细胞和培养基
• 8.1.2 重组腺病毒制备
• 8.1.3 CpL鸡胚适应毒
• 8.1.4 试验动物及分组
• 8.1.5 抗MOMP抗体持续水平监测
• 8.1.6 淋巴细胞增殖试验
• 8.1.7 攻毒试验
• 8.1.8 重组腺病毒安全性评价
• 8.1.9 疫苗保存期试验
• 8.2 结果
• 8.2.2 抗MOMP抗体水平变化检测
• 8.2.3 淋巴细胞增殖试验
• 8.2.4 攻毒试验
• 8.2.5 重组腺病毒安全性评价
• 8.2.6 疫苗保存期试验
• 8.3 讨论
• 第九章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历