纤维素酶基因cel7A的克隆和番茄遗传转化体系建立

论文摘要

在人类生存的环境中有大量纤维素,它们很难被消化,大部分被浪费掉。二十世纪中期,纤维素酶被引入畜牧业,为人类的发展做出了一些贡献。截止到目前,人类对它的利用率仍然偏低,而传统的加工过程中酶制剂成活率往往不高。因此,有必要利用基因工程技术手段提高纤维素酶的利用率。真菌中存在着大量的纤维素酶,亚洲香菇（Lentinula edodes）,属于真菌的一种。本研究根据NCBI中香菇纤维素酶基因的mRNA序列设计引物,并设计HindⅢ和BamHⅠ两个酶切位点。以PDA液体培养基中培养得到香菇的为材料,用Trizol试剂提取香菇总RNA,通过RT-PCR方法获得香菇纤维素酶基因的cDNA片段。通过分子克隆技术将得到的目的片段克隆到pMD19-T载体上,酶切鉴定并进行基因测序。然后将该基因构建在改造的pCMABIA1302载体上,构建成植物表达载体pCMABIA1302-wjx,并用冻融法将该重组质粒导入根癌农杆菌菌株LBA4404中,构建成转化所用工程菌。以期利用农杆菌介导的遗传转化方法将克隆得到的纤维素酶基因转入玉米中并在玉米中进行表达,为进一步开展玉米转基因研究和生产高消化率的饲用玉米新品种创造了良好的条件。番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）,属于茄科（Solanaceae）,番茄属（Lycopersicon）。不同的番茄品种再生体系存在着一定得的差异,本研究采用太原的两个优势品种特选28和太原823,以这两个品种的番茄无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,对番茄的再生体系和农杆菌介导的番茄遗传转化体系进行了优化,建立了适合供试品种太原823和特选28的遗传转化体系。比较了在不同激素浓度以及不同激素浓度的配比的情况下对番茄无菌苗子叶和下胚轴不定芽分化所产生的影响,并对影响外植体转化效率的因素进行了探讨。植物表达载体质粒pBI121中携带的NPTII基因不仅提供了转化所用的目的基因,同时又能作为植物的筛选标记,赋予植物对卡那霉素的抗性。在本试验中采用农杆菌介导转化法,将NPTII基因导入番茄植株细胞,通过诱导培养和卡那霉素筛选,获得再生植株。结果表明:在农杆菌浸染前进行2天的预培养、农杆菌浸染浓度为OD600=0.3、浸染6min的外植体在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA的培养基上外植体再生芽苗率最高。通过建立高效遗传转化体系,以期为利用转基因技术进行生物反应器的研究奠定良好的基础。综上所述,本研究分为两部分内容。一部分通过分子克隆技术成功克隆到了纤维素酶基因cel7A。另一部分通过农杆菌介导的方法转化太原市的两个番茄品种（太原823和特选28）,获得了再生植株。这是首次将太原823和特选28首次通过农杆菌介导法转化并获得再生植株。转化的再生番茄植株有待于进一步进行分子检测,检测NPTII基转入番茄植株的情况。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 纤维素酶概述
• 1.1.2 番茄遗传转化的研究进展
• 1.2 研究目的及意义
• 1.2.1 纤维素酶基因克隆研究的目的和意义
• 1.2.2 转基因番茄研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 香菇纤维素酶基因cel7A的克隆
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 番茄高效组织培养再生体系的建立
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.2.3 试验方法
• 2.3 根癌农杆菌介导的番茄遗传转化
• 2.3.1 试验材料
• 2.3.2 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 香菇纤维素酶基因cel7A的克隆
• 3.1.1 香菇总RNA电泳分析结果
• 3.1.2 中间载体pMD19-T-cel7A构建结果
• 3.1.3 cel7A基因连接到载体pMD19-T的鉴定结果
• 3.1.4 植物表达载体pCAMBIA1302-wjx构建
• 3.1.5 农杆菌LBA4404转化植物表达载体pCAMBIA1302-wjx
• 3.2 番茄高效组织培养再生体系的建立
• 3.2.1 激素对番茄无菌苗下胚轴和子叶诱导生芽的影响
• 3.2.2 激素对番茄无菌苗子叶和下胚轴诱导生根的影响
• 3.3 根癌农杆菌介导的番茄遗传转化
• 3.3.1 外植体对卡那霉素的敏感性
• 3.3.2 农杆菌浸染时间对番茄遗传转化的影响
• 3.3.3 抗性植株再生结果分析
• 4 讨论
• 4.1 香菇纤维素酶基因cel7A的克隆
• 4.2 番茄高效组织培养再生体系的建立
• 4.2.1 番茄外植体的类型对不定芽苗分化的影响
• 4.2.2 培养基中激素对不定芽苗分化的影响
• 4.3 根癌农杆菌介导的番茄遗传转化
• 4.3.1 抗生素对番茄外植体筛选的影响
• 4.3.2 影响农杆菌介导外源基因转化的因素
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢
• 个人简况及联系方式