论文摘要
花生是我国重要的油料和经济作物,由青枯雷尔氏菌引起的青枯病是花生最重要的土传性细菌病害,是影响花生产量和品质的关键因子之一,目前还没有行之有效的化学防治手段。解决青枯病最有效的手段是培育抗病品种,但是传统杂交育种方法选育出的抗病品种存在周期长、抗性与高产优质负相关等问题,利用分子育种技术培育高产优质抗青枯病花生品种是有效解决花生受青枯病侵染的有效途径。目前国内外对花生抗青枯病的分子机理研究甚少,对控制青枯病的抗性基因数目、作用机制、花生-青枯菌互作的机理还不清楚。随着全基因组测序和功能基因组学的迅速发展,通过正反向遗传学的方法克隆花生抗青枯病基因,剖析花生-青枯菌的互作机制成为必然,由于花生的基因组庞大,通过正向遗传学图位克隆花生抗青枯病基因和解析花生抗青枯病的机理较为困难。因此,本研究旨在通过反向遗传学手段找到与青枯病相关的抗病基因,再通过转基因验证其功能,分析其抗病调控网络,这将有助于揭示花生抗青枯病分子机理,促进花生抗青枯病遗传改良。主要研究结果如下:1.采用蛋白质组学的方法对抗感青枯病花生品种在青枯菌侵染后的叶片的蛋白质组进行了比较。根据对青枯菌侵染的不同反应,筛选出了高抗的粤油92栽培种和高感的新会小粒栽培种。分别对两个品种4周大的幼苗用剪叶法进行青枯菌侵染,然后从受侵染的植株叶片中提取蛋白质,进行双向凝胶电泳、考马斯亮蓝染色、质谱分析、蛋白数据库比对。和各自的对照组相比,抗、感品种中共发现14种差异表达蛋白。这些蛋白中,有5个是诱导产生的,4个表达上调,2个表达下调,3个差异表达相反。这些蛋白主要参与光合作用、能量代谢、信号转导以及防御反应。总之,本研究为探明花生青枯病抗性的分子机制提供了新的见解。2.通过基因芯片技术在花生上比较筛选可能与青枯病抗性相关的基因。为了鉴定抗性有关的转录本的变化,本实验根据花生全组织、花生生物和非生物胁迫的454测序结果整合Genebank上的EST序列合成了包含有101,344条unigenes的高密度的cDNA芯片（Roche NimbleGen基因表达芯片）,比较抗感青枯病品种接种青枯菌后mRNA芯片杂交结果分析了两个品种的表达谱差异,经过t检验FDR≤0.05,选择log2≥1或者log2≤-1为差异基因,青枯菌侵染后,抗病品种粤油92有2,638个基因表达上调,1,410个基因表达下调,在感病品种新会小粒中,有1,551个基因表达上调,2,054个基因表达下调,通过5个差异基因的qRT-PCR验证了芯片的可靠性。GO注释和pathway分析显示抗感品种中差异基因功能注释的结果差异较大,参与的代谢途径感病品种中参与的差异基因较多。一些与抗病相关的重要基因如NBS-LRR类抗病基因、转录因子和激酶类基因在抗病品种上调的较多,而在感病品种中下调的较多,这些基因的差异表达可能与青枯菌侵染花生后的防御应答有关,可能参与了花生的青枯病的抗性。3.富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶（LRR-RLK）具有调节植物生长发育、参与抗逆反应和防卫反应等生理功能。本研究通过基因芯片分析,获得了一个受青枯菌诱导差异表达上调的LRR-RLK类抗病基因AhRLK1,通过RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,该基因全长3,292bp,编码992个氨基酸,对其结构分析表明具有一段信号肽、一个胞外激酶区和9个LRR保守结构域,农杆菌渗入法注射烟草叶片对其亚细胞定位显示35S::AhLK1-GFP融合蛋白定位于细胞膜上,通过荧光定量对其表达模式分析结果表明,AhRLK1在青枯菌侵染后在感青枯病花生品种新会小粒持续上调表达,而在抗病品种粤油92中变化不大,SA、ABA、ET、JA、PAC激素处理后能上调表达,在干旱和低温处理中下调表达。该基因瞬间超表达本氏烟草叶片能引起HR反应,构建超量表达载体农杆菌介导转化烟草CB-1,超表达AhRLK1明显能够增强对青枯菌的抗性。与对照相比,AhRLK1超量表达的转基因烟草在接种青枯菌后一系列防御反应相关基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtHPR3,NtHPR4,NtCHN50,NtPR1b,NtPR2,NtEFE26和NtAcs6都能够明显上调表达。推测AhRLK1可能参与花生对青枯菌的防御反应,可能参与青枯菌侵染早期对病原菌的识别,还参与了植物的非生物胁迫防御反应。AhRLK1基因的获得对于研究花生抗青枯病相关基因的结构和功能以及青枯病抗病遗传育种奠定了基础。4.NBS-LRR类抗病基因是目前已知的植物抗病基因最大家族,在植物的抗病防御反应中起着重要作用。本研究通过基因芯片分析,获得了一个受青枯菌诱导上调表达的NBS-LRR类抗病基因AhRRS5,通过RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,该基因全长3,157bp,编码943个氨基酸,对其结构分析表明具有典型的NBS-LRR类保守结构域,基因枪法转化洋葱表皮实验表明,35S::AhRRS5-GFP融合蛋白定位于细胞核中,荧光定量结果表明,AhRRS5在青枯菌侵染72h内抗感花生品种中都能上调表达,在感病材料中表达上调的幅度较大,受SA、ABA、ET、JA、PAC激素的上调表达,在干旱和低温处理中也能上调表达。该基因瞬间超表达本氏烟草叶片能引起HR反应,构建超量表达载体农杆菌介导转化烟草CB-1,超表达AhRRS5明显能够增强对青枯菌的抗性。与对照相比,AhRRS5超量表达的转基因烟草在接种青枯菌后一系列防御反应相关基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtPR1b,Ntla/c,NtNPR1,NtEFE2 和NtAcs6都能够明显上调表达。推测AhRRS5可能参与花生对青枯菌的防御反应,并且是通过多种信号途径复杂的调控网络实现的。AhRRS5基因的获得对于研究花生抗青枯病相关基因的结构和功能以及青枯病抗病遗传育种奠定了基础。