论文摘要
脊髓损伤是指脊髓遭受损害导致机体的感觉、运动、反射和植物神经系统功能出现障碍的一种严重损伤。其损伤程度不仅取决于原发性损伤,而且关系到继发性损伤的进展,继发性的损伤可进一步加剧损伤并影响其恢复。原发性损伤在创伤的瞬间形成,不能控制;减轻损伤的程度,主要着眼于继发性损伤。近十年来,随着分子生物学和细胞生物学等现代生命科学技术的发展,脊髓损伤（Spinal cord iniury,SCI）修复的研究有了长足进步。目前对于SCI修复的治疗研究主要集中于药物治疗、组织及细胞移植治疗两方面。哺乳动物的中枢神经系统具有神经干细胞,虽然哺乳动物胚胎及成体的中枢神经系统具有这种细胞,但由于绝对数量和微增殖环境的限制,损伤后使神经组织自我修复作用有限,只在合适的条件下,可以自我增殖和多向分化;移植神经干细胞,不仅可以激活内源性神经干细胞,促进内源性神经干细胞的分化和迁移,还可弥补内源性神经干细胞的不足;但如何标记移植的神经干细胞?绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,当受到紫外或蓝光激发时,能发射绿色荧光。和其他标记物相比,绿色荧光蛋白拥有操作简便、结果直观等优点,从而被广泛应用于转基因动物、融合标记、基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化以及病原菌侵入活细胞示踪等领域。近年的研究表明,绿色荧光蛋白标记在移植干细胞的示踪、定量分析、分化状态的检测等方面显示了良好的应用前景。研究发现,药物,神经营养因子的应用可以改善脊髓生理环境,减少细胞凋亡,促进组织再生和功能恢复的作用。Neuregulin（NRG）是一类多肽因子,它们最初是从不同的生物体,包括细胞分化、增殖、存活和迁移实验中分离纯化和克隆的。Neuregulin与其受体ErbB的结合后,启动MEK/ERK等激酶信号传递途径,参与神经肌肉接头AchR的突触合成,雪旺氏细胞和少突胶质细胞的发育和成熟,此外还参与神经元的存活和神经突起的生长。本研究目的:①通过无血清培养技术从GFP+-大鼠胚胎脊髓分离和培养神经干细胞（NSC）,采用免疫荧光技术鉴定神经干细胞,观察NSC的分化功能和Neuregulin-1的表达。②建立大鼠脊髓半横切损伤模型,向损伤脊髓处附近植入GFP+-神经干细胞,并局部皮下注射Neuregulin-1,研究GFP+-神经干细胞在Neuregulin-1的作用下的存活、分化和迁移。③连续使用BDA皮质脊髓束顺行示踪技术和实验动物脊髓BBB运动功能评分等方法评价脊髓运动及神经传导功能的修复。研究结果表明:脊髓损伤后,GFP+-脊髓源性的神经干细胞移植联合应用Neuregulin-1,可使SCI获得比较好的治疗效果。目前文献上尚未见过GFP+-神经干细胞在Neuregulin-1作用下对损伤脊髓的治疗作用的报道。本实验研究包括如下三个部分:第一部分,材料和方法:采用免疫荧光技术鉴定从具有绿色荧光蛋白基因的怀孕16d大鼠胚胎脊髓分离和培养神经干细胞,观察NSC的分化和Neuregulin-1的表达,结果:在原代培养3天后即可见神经球的出现,随着时间的推移,神经球的数量迅速增加,培养7d时神经球逐渐长大,比较大的为肉眼可见的白色小颗粒,细胞间排列致密。在传代的过程中发现部分神经干细胞自然贴壁后发生分化并死亡。在多次传代培养后即可得到纯化的神经干细胞。培养的神经球可连续传代获得大量克隆细胞。原代培养3d形成的神经球因本身就携带GFP基因,故在荧光显微镜下即可观察到神经球有很强的绿色荧光。对原代培养7d的神经球进行Neuregulin-1和Nestin免疫荧光组化染色,可见神经球中大多数细胞呈Nestin阳性,Neuregulin-1有明显的表达。克隆球经体外贴壁、迁移、分化及β-tubulin、GalC和GFAP免疫组化染色鉴定。结果表明,GFP+-大鼠胚胎脊髓源神经干细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,这些神经干细胞的分化能力经多次传代后仍保持稳定。结论:本实验采用携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的怀孕16天大鼠,成功分离GFP+大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞,体外进行诱导分化和鉴定,建立了一套较简单的GFP+-大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞分离、鉴定的方法。经免疫荧光单标染色方法证明GFP+-神经干细胞能表达Neuregulin-1和Nestin,为神经干细胞的进一步研究和临床应用奠定了基础。第二部分,材料和方法:建立大鼠脊髓半切损伤模型,利用BDA皮质脊髓束顺行示踪技术检测脊髓损伤模型中皮质脊髓束连续性的变化。向损伤脊髓处附近植入GFP+-神经干细胞,同时局部应用Neuregulin-1。两个月后,用免疫荧光染色方法在移植细胞的脊髓处观察Nestin、GaI-C、β-tubulin、GFAP和Neuregulin-15个抗体的表达。结果显示:成功建立大鼠脊髓损伤模型,通过BDA顺行神经束示踪技术证实SCI的完全性,脊髓半切断损伤组,BDA染色在损伤邻近处终止,而在以下脊髓节段双侧脊髓白质中未见BDA阳性染色的皮质脊髓束神经纤维;正常对照组则显示BDA阳性染色皮质脊髓束纤维通过整个脊髓全长,延伸至腰髓水平。免疫荧光染色结果提示术后2个月后在损伤处附近仍表达Nestin阳性移植细胞,以GFP+-神经干细胞+NGR-1（20μg/kg）和GFP+-神经干细胞+NGR-1（100μg/kg）组的细胞数最多,Gal-C和β-tubulin在脊髓损伤模型内的表达量也在上述的两个组比其他组多,但无明确统计学的意义,单用培养液（DMEM）组的数量最少。Neuregulin-1的表达在GFP+-神经干细胞移植+Neuregulin-1联合作用下不仅在脊髓损伤附近处的表达量多于无移植细胞,无注射NGR-1组,而且随Neuregulin-1注射剂量的变化,也具有表达量的差异。在5个抗体表达量中GFAP抗体表达量最少。结论:本研究制作了脊髓半切损伤动物模型,采用BDA神经束示踪技术证明半切完全,建模成功。Neuregulin-1皮下注射后于损伤部位移植的GFP+-神经干细胞在损伤2个月后仍能较好地生存和增殖并表达5种抗体。应用Neuregulin-1后GFP+-神经干细胞比单纯移植的GFP+-神经干细胞在损伤脊髓的存活能力强。第三部分:材料和方法:应用BDA皮质脊髓束顺行示踪技术和实验动物脊髓BBB功能评分方法,观察实验动物的脊髓运动和神经传导功能的恢复情况。结果显示:单损伤组和培养液移植组,BDA染色阳性在损伤邻近处终止,而在以下脊髓节段双侧脊髓白质中未见BDA阳性染色的皮质脊髓束神经纤维。在单独GFP+-神经干细胞移植组以及GFP+-神经干细胞移植+Neuregulin-1的联合应用组群的神经纤维向损伤远侧段生长的神经纤维较少,但能通过损伤空洞延伸进入邻近组织。术前所有组实验动物左右后肢BBB评分均为21分,但在术后1周内,各组之间的差异无显著性意义（P＞0.05）。移植后2个月,DMEM组与单纯GFP+-神经干细胞移植组、单独GFP+-神经干细胞与GFP+-神经干细胞移植+NGR-1（5gg/kg）组和GFP+-神经干细胞+NGR-1（5μg/kg）与GFP+-神经干细胞+NGR-1（20μg/kg）组之间的差异也具有显著性意义（P＜0.05）,其余各组之间的评分差异均无显著性意义（P＞0.05）。结论:损伤后6周,采用BDA神经束示踪技术评价断伤脊髓的神经传导通路修复程度,在GFP+-神经干细胞和GFP+-神经干细胞+Neuregulin-1的联合应用组群中神经纤维通过损伤空洞向损伤远段生长,但单损伤组和移植培养液组神经纤维生长在损伤邻近处终止,在损伤处以下未见BDA染色阳性的皮质脊髓束神经纤维;而且无法区别单独移植神经干细胞和神经干细胞+Neuregulin-1联合应用组群之间再生轴突的染色差异,不同浓度Neure-gulin-1组间BDA染色也未发现明显差异。BBB评分显示建立模型后2个月未移植干细胞组和未注射Neuregulin组的修复情况较其他各组差,其中GFP+-神经干细胞+Neuregulin-1（100μg/kg）组BBB评分最高,但仍低于正常值（21分）,神经干细胞+Neuregulin-1联合应用组内Neuregulin20μg/kg和100μg/kg之间无明显统计学差异。