胆红素氧化酶的制备及应用

论文摘要

胆红素氧化酶（bilirubin-oxidase,简写为BOD, EC.1.3.3.5）是一种临床诊断用酶,通过它检测人体内胆红素水平可判断是否患有肝脏等疾病。本实验以露湿漆斑菌（Myrothecium roridum, MTR）为原材料,经过冷冻干燥浓缩,DEAE-Sepharose阴离子交换层析对MTR BOD进行了分离纯化,获得电泳纯。实验测定其分子量约为51kD、等电点为4.5,希夫试剂染色证明其为糖蛋白。这些生化特性都与疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria, MV） BOD不同,而且稳定性更佳。根据Genbank中MVBOD基因和多酚氧化酶的保守区序列设计简并引物,利用PCR从MTR的染色体DNA中扩增得到长度为1.2kb的基因片段。通过序列比对,MTR BOD与MVBOD基因相似性可达95.35%。本实验还建立了一活性染色法,该方法通过BOD能够特异地将胆红素氧化成胆绿素的原理,利用酶与底物的特异反应,可以在凝胶上进行底物染色来直接显示酶的活性区带。这种活性染色可以采用胆红素直接溶入分离胶后电泳（胆红素-PAGE）,也可以在电泳后置于胆红素溶液中染色（PACE-胆红素）。其中PAGE-胆红素方法在20min后即在凝胶上出现深绿色的BOD条带,随着时间延长,凝胶上的绿色酶条带逐渐扩散,最终形成透明条带；而运用胆红素-PAGE的方法则在12h后才能在凝胶上看见透明的BOD所在的条带。相比之下,前者更为简便、快速、灵敏。利用MTR BOD,测定人血清总胆红素,胆红素浓度为0-70μg/mL的范围内线性基本保持良好,初步证明MTR BOD具有临床应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 序言
• 1.1 胆红素
• 1.1.1 胆红素简介
• 1.1.2 胆红素分析测定的意义
• 1.1.3 血清胆红素的测定方法
• 1.1.4 胆红素与酶法测定相关的生化特性
• 1.2 BOD
• 1.2.1 BOD的发现
• 1.2.2 BOD的组成和性质
• 1.2.3 BOD的氧化反应
• 1.2.4 BOD的底物特异性
• 1.2.5 BOD的纯化
• 1.2.6 分子方面研究进展
• 1.2.7 BOD的应用
• 1.3 研究目的和意义
• 第2章 BOD产生菌的发酵与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与试剂
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂与仪器
• 2.2.3 培养基的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 胆红素氧化酶的鉴定
• 2.3.2 BOD活测定方法
• 2.4 结果和讨论
• 2.4.1 BOD产生菌的形态观察
• 2.4.2 酶的定性实验
• 2.4.3 胆红素的吸收光谱
• 2.4.4 胆红素自氧化曲线
• 2.4.5 发酵条件的确定
• 2.4.6 小结
• 第3章 BOD凝胶电泳活性染色法
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 主要实验试剂
• 3.2.4 电泳及活性染色
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 活性染色效果和条件
• 3.3.2 活性染色方法的特异性
• 3.3.3 活性染色方法的灵敏度
• 3.3.4 MTR BOD分子量的初步确定
• 3.4 小结
• 第4章 BOD的分离纯化及性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 试剂与仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 酶的冷冻干燥
• 4.3.2 DEAE离子交换层析
• 4.3.3 等电点的测定
• 4.3.4 MTR BOD储藏稳定性的研究
• 4.3.5 MTR BOD糖蛋白性质鉴定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 酶的分离纯化
• 4.4.2 MTR BOD的分析
• 4.4.3 MTR BOD稳定性的研究
• 第5章 MTR BOD基因的克隆
• 5.1 引言
• 5.2 试剂与仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 DNA提取
• 5.3.2 引物设计
• 5.3.3 PCR扩增
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 MTR BOD染色体DNA的制备
• 5.4.2 MTR BOD PCR扩增
• 5.4.3 MTR BOD PCR产物测序
• 5.5 小结
• 第6章 BOD的测定总胆红素的质量评价
• 6.1 引言
• 6.2 试剂与仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 BOD测定总胆红素的线性范围
• 6.3.2 BOD测定总胆红素的质量评价
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 BOD测定总胆红素的线性范围
• 6.4.2 总胆红素含量测定
• 6.5 小结
• 第7章 结论
• 参考文献
• 硕士研究生期间发表的论文
• 致谢