发夹型荧光分子探针用于DNA甲基化酶的研究

论文摘要

DNA甲基化是DNA与甲基化酶相互作用的结果,是DNA分子重要的碱基修饰方式之一,它可以影响到核酸的结构以及与蛋白质的相互作用等,进而影响到基因表达和肿瘤的发生发展,因而是一个引起广泛兴趣的研究领域。本论文利用荧光分子探针设计简便、灵活的特点,着眼于研究DNA与甲基化酶相互作用,开展的工作主要包括以下三个方面:1.发夹型荧光分子探针用于DNA甲基化酶的活性分析及其在药物筛选中的应用设计了茎部较长的发夹型荧光分子探针,该探针比传统的分子信标荧光探针具有更高的稳定性,甲基化酶和相应的限制性内切酶的识别位点被设计在发夹型探针的茎部,荧光基团被连接在探针的5’端,其荧光被连在3’端的熄灭基团所熄灭。限制性内切酶可切割未发生甲基化修饰的探针,导致探针的发夹结构遭到破坏,引起荧光基团荧光信号的恢复。根据荧光信号的恢复程度可实现对甲基化酶活性的分析。在此基础上,建立了一种简便、快速分析抗肿瘤药物对DNA甲基化酶活性的影响的方法,为筛选针对基因甲基化异常引起的恶性肿瘤的治疗药物提供了一种新的思路和方法。2.发夹型荧光分子探针用于实时监测Taq I甲基化酶对DNA的甲基化利用发夹型荧光分子探针设计的灵活性,根据Taq I甲基化酶和Dpn I限制性内切酶识别序列关系,在分子探针的茎部设计了两个相邻的Taq I甲基化酶的识别位点,当探针茎部两个识别位点被Taq I甲基化酶修饰时可形成限制性内切酶Dpn I的切割位点,发夹结构的茎部被Dpn I切割而释放荧光信号,实现了实时监测Taq I甲基化酶对分子探针的甲基化过程,根据切割反应的初始速率实现了Taq I甲基化酶活性的分析,该分析过程非常简便、快速。3.酶识别序列外DNA甲基化对酶与DNA相互作用的影响合成了酶识别序列外的胞嘧啶或腺嘌呤发生了甲基化修饰的分子探针,利用该探针定性地考察了酶识别序列外DNA甲基化对限制性内切酶、甲基化酶与DNA相互作用的影响。该分析方法简便、快速,为研究酶识别序列外甲基化对酶与DNA相互作用的影响提供了一种新的简便方法。

论文目录

• 学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书
• 摘要
• Abstract
• 本文所用英文缩写词表
• 第1章 绪论
• 1.1 DNA 甲基化
• 1.1.1 DNA 甲基化的形式
• 1.1.2 DNA 甲基化与基因表达
• 1.1.3 DNA 甲基化与肿瘤
• 1.2 核酸分子探针
• 1.2.1 经典核酸分子探针
• 1.2.2 分子信标
• 1.2.3 Break light 探针
• 1.2.4 其它新型核酸分子探针
• 1.3 本论文拟开展的工作
• 第2章 发夹型荧光分子探针用于DNA 甲基化酶的活性分析及其在药物筛选中的应用
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 原理
• 2.3.2 甲基化反应的动力学分析
• 2.3.2 M.Alu Ⅰ活性的定量分析
• 2.3.3 抗癌药物对M.Alu Ⅰ活性的影响
• 2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4 小结
• 第3章 发夹型荧光分子探针用于实时监测Taq I 甲基化酶对 DNA 的甲基化过程
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 原理
• 3.3.2 温度对反应速率的影响
• 3.3.3 SAM 浓度对反应速率的影响
• 3.3.4 M.Taq I 活性的定量分析
• 3.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳样品的分析
• 3.3.6 保护碱基数目对反应速率的影响
• 3.4 小结
• 第4章 发夹型荧光分子探针用于酶识别序列外的甲基化对酶与DNA 相互作用影响的初步研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 酶识别序列外胞嘧啶的甲基化对限制性内切酶与DNA 相互作用的影响
• 4.3.2 酶识别序列外腺嘌呤的甲基化对限制性内切酶与DNA 相互作用的影响
• 4.3.3 酶识别序列外碱基的甲基化对甲基化酶与 DNA 相互作用的影响
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录（攻读学位期间所发表的学术论文目录）
• 致谢