甜菜夜蛾性信息素结合蛋白的RNA干扰及嗅觉受体基因的表达谱

论文摘要

昆虫在长期进化过程中形成了高度灵敏的嗅觉系统,并以此来感受自然环境中的各种化学信息,产生相应的生理和行为反应,如寻找配偶、食物源和栖息场所、产卵行为、逃避危险或者不适合的栖息地和寄主等。将昆虫嗅觉应用于害虫防治,已成为害虫管理的一个重要手段,并将在未来害虫治理中起到越来越重要的作用。深入研究蛾类昆虫性信息素通讯的分子机制,弄清性信息素感受相关蛋白的功能,对于针对特定嗅觉蛋白设计和开发更为高效的基于两性通讯的害虫调控技术,至关重要。昆虫信息素结合蛋白（PBP）及受体蛋白（OR）被认为在性信息素感受中起重要作用,但目前为止在活体昆虫内进行该类蛋白功能的研究国内外还没有报道。在课题组前期成功克隆出甜菜夜蛾性信息素结合蛋白1（SexigPBP1）和信息素受体蛋白2（SexiOR2）全基因序列的基础上,本研究重点利用RNAi技术对SexigPBP1基因的功能进行了研究,同时对嗅觉受体蛋白SexiOR2和SlitOR2的组织分布进行了调查,主要结果如下:1)设计引物并通过RT-PCR扩增出530 bp的SexiPBP1 DNA片段,并以此为模板合成用于RNAi的双链SexiPBP1RNA。2)通过腹腔注射法将双链RNA导入到初羽化雄蛾体内,48小时后的RT-PCR和qRT-PCR的检测结果表明,处理试虫触角内SexigPBP1基因的表达量被敲减了约90%,同时处理试虫死亡率和对照相比没有明显差异。说明该方法可以有效沉默昆虫PBP基因的表达,从而进行相关功能研究。3)进一步的触角电位（EAG）检测结果表明,RNAi处理48小时后,雄蛾对雌蛾性信息素主组分Z9,E12,14:Ac的EAG反应降低了约60%,直接证明SexigPBP1在雄蛾对该组分的感受中起重要作用。这是首次应用RNA干扰技术对蛾类昆虫PBP功能的研究报道。4)通过设计特异性引物,以RT-PCR方法对嗅觉受体基因SexiOR2和SlitOR2分别在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中的组织表达谱进行了分析。结果表明,SexiOR2和SlitOR2基因只表达于雌雄蛾的触角中,在头、胸、腹、足、喙、翅等其他部位没有表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 嗅觉感器及触角感受机制
• 2 昆虫信息素结合蛋白的研究进展
• 2.1 昆虫信息素结合蛋白的分子特征
• 2.2 信息素结合蛋白在触角中的分布
• 2.3 昆虫信息素结合蛋白与信息素分子的结合与释放机制
• 2.4 昆虫信息素结合蛋白的生理功能
• 3 RNA干扰的研究概况
• 3.1 RNA干扰的研究的历史
• 3.2 RNA干扰的分子机理
• 3.2.1 转录后基因沉默机理
• 3.2.2 RNA干扰的起始阶段
• 3.2.3 RNA干扰的效应阶段
• 3.2.4 RNA解旋酶蛋白家族
• 3.2.5 沉默信号的传递与放大
• 3.2.6 蛋白质翻译水平:
• 3.2.7 RNA介导的基因组甲基化
• 3.3 系统性RNA干扰
• 3.3.1 线虫中的系统性RNA干扰
• 3.3.2 蜜蜂中的系统性RNA干扰
• 3.3.3 果蝇中的细胞自主性RNA干扰
• 3.3.4 人类中的系统性RNA干扰
• 3.3.5 德国小蠊中的RNA干扰
• 3.3.6 蝗虫中的RNA干扰
• 3.3.7 其他昆虫中的RNA干扰
• 第二章 甜菜夜蛾信息素结合蛋白1基因干扰片段的获得与活体导入研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 主要试剂和仪器设备
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 主要仪器设备
• 1.3 昆虫总RNA的提取
• 1.4 cDNA第一链的合成
• 1.5 PCR引物设计
• 1.6 PCR扩增
• 1.7 PCR产物纯化、克隆、测序和序列分析
• 1.7.1 PCR产物纯化
• 1.7.2 连接反应
• 1.7.3 转化反应
• 1.7.4 小量质粒DNA的提取
• 1.7.5 序列测定
• 1.7.6 序列分析
• 1.8 双链RNA的合成与虫体注射
• 1.8.1 双链RNA的体外转录合成
• 1.8.2 试虫注射
• 1.8.3 注射后试虫存活率调查
• 2 结果与分析
• 2.1 甜菜夜蛾PBP基因靶标片段的克隆与分析
• 2.2 注射法将双链RNA导入试虫体内
• 2.3 体腔注射法将双链RNA导入试虫体内死亡率分析
• 3 讨论
• 第三章 RNA干扰后甜菜夜蛾信息素结合蛋白1基因的表达水平分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要试剂和设备
• 1.3 昆虫核酸提取
• 1.4 半定量和定量PCR引物设计
• 1.5 半定量PCR扩增
• 1.6 PCR产物纯化、克隆和测序
• 1.7 甜菜夜蛾PBP基因的定量PCR分析
• 1.7.1 实时荧光定量PCR反应
• 1.7.2 甜菜夜蛾PBP基因mRNA表达量比较
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA干扰后目标基因mRNA的RT-PCR检测
• 2.2 RNA干扰后目标基因mRNA的qRT-PCR检测
• 3 讨论
• 第四章 RNA干扰后甜菜夜蛾的电生理检测
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 触角电位（EAG）测定
• 2 结果与分析
• 2.1 脱靶效应分析
• 2.2 注射后不同时间的触角电位分析
• 2.3 处理48小时后试虫对性信息素主组分的触角电位反应
• 3 讨论
• 第五章 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾OR2基因的组织表达谱
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 总RNA的提取及cDNA第一链的合成
• 1.4 PCR引物设计
• 1.5 PCR扩增
• 2 结果与分析
• 2.1 甜菜夜蛾嗅觉受体基因的组织定位分析
• 2.2 斜纹夜蛾受体基因的组织定位分析
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录:攻读硕士学位期间学术论文的发表情况
• 致谢