水稻（Oryza sativa L. ssp japonica）成熟与萌发花粉的蛋白质组学研究

论文摘要

花粉是高度退化的两细胞或三细胞生物体。作为雄配子体,花粉储藏了父本的全部遗传信息,并通过与柱头识别、萌发和花粉管极性生长将精子送到雌性的胚囊中,完成双受精作用。由于花粉在植物有性生殖过程中的特殊作用和花粉管极性生长的独特细胞学过程,几十年来一直被作为研究这一系列精细细胞学过程的模式,但是其中关键事件的分子机制并不十分清楚。我们利用蛋白质组学技术鉴定了水稻成熟花粉三个不同组分（花粉外被蛋白、花粉外被/细胞壁相关和可释放蛋白、花粉内在蛋白）中表达的共322种蛋白质。其中,参与信号转导（10%）、细胞壁重塑和代谢（11%）、蛋白质代谢（14%）以及糖类和能量代谢（25%）的蛋白质被高度代表。并且很多是首次被在成熟花粉中得到鉴定的具有重要功能的蛋白质,包括蛋白激酶、受体激酶相互作用蛋白、GDP解聚抑制因子、含有C2结构域蛋白质和亲环蛋白等参与信号转导的蛋白质,eIF4A、线粒体加工肽酶、UFD1和AAA+ ATP酶等参与蛋白质合成、装配和降解的蛋白质,以及逆糖基化多肽、似纤维素合酶OsCsLF7等参与细胞壁重塑和代谢的蛋白质等。生物信息学分析表明,在我们鉴定的蛋白质中有11%的蛋白质功能未知并且不含有任何已知的功能结构域。另外,我们利用从头测序技术鉴定了5种新蛋白质。这些首次在花粉中被鉴定的蛋白质、未知功能蛋白质和新蛋白质在花粉萌发过程中的生物学功能值得进一步研究。进而,我们利用比较蛋白质组学技术获得了水稻花粉体外萌发过程中差异表达的160个鉴定结果（代表120种蛋白质）,生物信息学分析表明它们隶属于13个功能类群。其中,参与细胞壁代谢（占24%,如UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和第三类过氧化物酶）、蛋白质代谢（占11%,如eIF4A和20S蛋白酶体的亚基）、细胞骨架动力学（占8%,如肌动蛋白、微管蛋白和profilin）和胁迫反应（占7%,如抗坏血酸过氧化物酶）以及糖类和能量代谢（占24%）的蛋白质被高度代表。共有94个鉴定结果（73种蛋白质）在花粉萌发过程中表达丰度上调,包括几乎全部参与蛋白质代谢的蛋白质,多数参与细胞骨架动态变化和离子转运的蛋白质,以及部分参与糖类和能量代谢的蛋白质等。并且有53个鉴定结果（41种蛋白质）可能在萌发过程中被释放到培养基中

论文目录

• 摘 要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 花粉生物学研究进展
• 1.1.1 花粉的结构特征
• 1.1.2 花粉的发生
• 1.1.3 花粉-柱头识别与花粉萌发
• 1.1.4 花粉管结构与生长特点
• 1.1.5 花粉的基因表达
• 1.1.6 花粉蛋白质组研究
• 1.1.7 花粉蛋白质组与转录组的关系
• 1.1.8 蛋白质组学技术平台
• 1.2 本研究工作的目的、意义和实验设计
• 1.2.1 研究工作的目的和意义
• 1.2.2 研究工作的实验设计和技术路线
• 2 实验材料和实验方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水稻培养
• 2.1.2 花粉采集
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 花粉萌发
• 2.2.2 花粉细胞学观察
• 2.2.3 花粉蛋白质的提取
• 2.2.4 蛋白质的分离
• 2.2.5 电泳凝胶图像分析
• 2.2.6 蛋白质凝胶斑点切取
• 2.2.7 蛋白质胶内酶解
• 2.2.8 蛋白质样品脱盐
• 2.2.9 蛋白质质谱分析
• 2.2.10 质谱数据分析
• 2.2.11 蛋白质的生物信息学分析
• 2.2.12 Western 杂交分析
• 2.2.13 磷酸化蛋白质和糖基化蛋白质的凝胶染色分析
• 3 实验结果和分析
• 3.1 水稻花粉的形态特征
• 3.1.1 成熟水稻花粉的形态特征
• 3.1.2 花粉萌发条件和特征
• 3.2 成熟花粉的两部分蛋白质组分分离和鉴定
• 3.2.1 成熟花粉两部分蛋白质组分的获得
• 3.2.2 成熟花粉外被/细胞壁相关和可释放蛋白质（PRPs）与花粉内在蛋白质（PIPs）分离
• 3.2.3 MALDI-TOF MS 鉴定
• 3.2.4 NanoESI Q-TOF MS/MS 鉴定
• 3.2.5 蛋白质de novo 序列分析
• 3.3 成熟花粉外被蛋白质的分离和鉴定
• 3.4 成熟花粉蛋白质的功能分析
• 3.4.1 已鉴定成熟花粉蛋白质功能类群
• 3.4.2 成熟花粉典型功能类群蛋白质分析
• 3.5 花粉萌发前后的蛋白质组差异分析
• 3.5.1 萌发花粉蛋白质表达谱
• 3.5.2 萌发后上调蛋白、下调蛋白和可能释放蛋白的划分
• 3.5.3 蛋白质功能注释和归类
• 3.5.4 鉴定蛋白质在不同功能类群中的分布
• 3.5.5 参与细胞壁重塑和代谢的蛋白质
• 3.5.6 参与糖和能量代谢的蛋白质
• 3.5.7 参与蛋白质代谢的蛋白质
• 3.5.8 参与细胞骨架动态变化的蛋白质
• 3.5.9 参与信号转导的蛋白质
• 3.5.10 参与离子转运的蛋白质
• 3.5.11 参与胁迫反应和其它过程的蛋白质
• 3.5.12 24 种蛋白质的多个同工型在萌发过程中表达丰度改变
• 4 讨论
• 4.1 萌发花粉表现出与成熟花粉相似的中高丰度蛋白质表达谱
• 4.2 细胞壁相关蛋白质在萌发前后差异表达蛋白质中和成熟花粉蛋白质组中被高度代表是花粉功能特异性的重要特征
• 4.3 活跃地蛋白质合成和选择性降解可能对花粉管生长有重要作用
• 4.4 以多种同工型形式存在的蛋白质可能在花粉萌发和花粉管生长过程中具有重要的作用
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附表1
• 附表2
• 附表3
• 致谢
• 个人简历