一株禽流感病毒部分基因的克隆及表达研究

论文摘要

本研究采用RT-PCR方法对H9N2亚型禽流感病毒Ck/GS/2/99（H9N2）株聚合酶基因（PB2、PB1和PA）和非结构蛋白基因片段（NS）分别进行扩增,并将其克隆到pGEM-Teasy载体后进行序列测定与分析。以重组质粒pGEM-T-HA,pGEM-T-NA、pGEM-T-NS和pET-28 a（+）载体,构建HA、NA和NS1基因的原核表达载体pET-HA、pET-NA和pET-NS1,并将这三个表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达及进行反应活性研究。结果表明:该株病毒的PB2、PB1、PA和NS基因开放阅读框（ORF）分别由2280、2274、2151和890个碱基组成,分别编码759、757、716和272个氨基酸;经同源性与系统发生树分析表明:该毒株PB2、PB1、PA和NS都与Ck/NX/4/99株的核苷酸和氨基酸同源性在98%以上,另外这几个基因都与Ck/NX/4/99、Sw/HK/10/98、Ck/SHJZH/2/99、HK/156/97关系密切。成功构建了重组表达载体pET-HA、pET-NA和pET-NS1,转化E. coli Bl 21（DE3）感受态细胞,以终浓度0.8mmol/L、0.9 mmol和0.8 mmol/的IPTG诱导表达7h,6h和6h,能高效表达HA、NA和NS1蛋白,相对分子质量分别为约62KD、52KD和25 KD。HA和NA基因表达产物经纯化后能与该亚型的AIV鸡血清发生特异性反应;NS1蛋白纯化产物能与该亚型的AIV活病毒感染鸡血清发生特异性反应,而与疫苗免疫血清不发生特异性反应。因此,本研究所表达的HA和NA蛋白将用于检测H9N2亚型的禽流感病毒感染血清,NS1基因表达产物可作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原。

论文目录

• 中文摘要
• SUMMARY
• 缩略词表
• 第一部分 研究报告
• 前言
• 第一章 一株 H9N2 亚型禽流感病毒聚合酶基因和非结构基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR 扩增
• 2.2 PCR 产物的克隆和鉴定
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 禽流感病毒 HA、NA 基因在大肠杆菌中的表达及反应活性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 目的基因的扩增
• 2.2 重组表达载体的鉴定和序列分析
• 2.3 表达重组蛋白最佳诱导条件的确定
• 2.4 表达产物纯化及 Western-blot 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 禽流感病毒 NS1 基因在大肠杆菌中的表达及反应活性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 NS1 基因的扩增产物
• 2.2 表达载体的酶切、PCR 鉴定
• 2.3 表达重组蛋白最佳诱导条件的确定
• 2.4 表达产物的可溶性及 Western-blot 分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 1 A 型流感病毒的分子生物学特性
• 1.1 病原学特征
• 1.2 A 型流感病毒基因组的结构及其编码蛋白的功能
• 1.3 流感病毒的变异
• 2 H9N2 亚型禽流感病毒的研究进展
• 2.1 H9N2 亚型 IV 的流行特点
• 2.2 H9N2 亚型 IV 对人类的潜在威胁
• 2.3 禽流感病毒 H9N2 亚型的变异特性
• 3 禽流感病毒跨种属感染人的机制研究进展
• 3.1 人呼吸道抗 AIV 感染的非特异种属屏障
• 3.2 AIV 对人呼吸道的感染机制
• 4 禽流感病毒检测技术研究进展
• 4.1 病原学检测
• 4.2 血清学检测
• 4.3 单链构型多态性（SSCP）
• 4.4 核酸扩增方法
• 4.5 基因芯片
• 4.6 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介