东亚飞蝗Parental RNAi技术体系建立以及hunchback基因功能研究

论文摘要

东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis （Meyen）是我国最重要的农业害虫之一,从温带到热带都有分布,常爆发式为害,并能远距离迁移。由于全球气候异常、旱涝频繁、农业生态环境变化和大量施用化学农药等多方面的因素,我国蝗害发生和成灾面积又有回升趋势。而且,飞蝗是昆虫神经生物学、发育生物学和系统演化等方面研究的重要模式生物。近年来,在分子水平探索飞蝗的生命特征已逐渐成为热点,已经有大量的基因被克隆。因此,需要一种行之有效的方法来解读这些基因的功能。本研究采用parental RNAi方法来建立东亚飞蝗的基因功能研究技术体系,并用该方法研究东亚飞蝗hunchback基因的功能。现将主要研究内容和结果总结如下:①hunchback基因的克隆采用PCR、RT-PCR、RACE等方法克隆了东亚飞蝗的hunchback基因,并根据cDNA序列推导出氨基酸序列,分别登录到GenBank,登录号为DQ340870和ABC69039.1。克隆到的东亚飞蝗hunchback基因cDNA序列长3774bp,开放阅读框为5-2545,共编码846个氨基酸,推测蛋白分子量为92.09 kDa。Hunchback蛋白共有8个锌指因子:氮端2个（NF-1、NF-2）、中间4个（MF-1、MF-2、MF-3和MF-4）和碳端2个（CF-1、CF-2）。除此之外,还有A Box、C Box和Basic Box等结构域。②东亚飞蝗parental RNAi通过体外转录制备dsRNA,将dsRNA直接注射到东亚飞蝗雌成虫的血腔里。注射dsRNA后,所有的蝗虫都存活下来,一周后开始陆续产卵。与对照相比,注射dsRNA蝗虫的产卵量没有明显差异,说明dsRNA不影响蝗虫的生殖力。注射hunchback dsRNA的胚胎,已基本上检测不到hunchback mRNA,而注射缓冲液空白组和无关gfp dsRNA分子的对照组则没有明显改变。与对照相比注射dsRNA胚胎的Hunchback蛋白含量下降了将近4倍,而β-tubulin蛋白没有变化。说明RNAi特异性地抑制了内源靶基因的沉没,而没有对其他基因的表达产生影响。根据胚胎表型的严重程度,可以将hunchback基因沉默后的表型分为3类。表型I:颌、胸部体节发育正常,腹部严重缩短,胸足畸形,占8.4%。表型II:颌、胸部完全缺失,仅形成了前头部和一个缩短的腹部,占86.0%。前头部包括复眼、上唇和触角,由于大面积组织缺失,两个复眼长到了一起,形成典型的“V”形复眼。腹部仅形成了6-7个腹节,缺失了3-4个腹节。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 研究意义与背景
• 1.2 RNAi 技术的研究进展
• 1.2.1 RNAi 研究的历史及概况
• 1.2.2 RNAi 的作用机制
• 1.2.3 系统性RNAi
• 1.2.4 昆虫RNAi 技术
• 1.2.5 RNAi 的生物学功能
• 1.2.6 RNAi 技术的应用
• 1.3 hunchback 基因的研究进展
• 1.3.1 昆虫胚胎发育的基因调控
• 1.3.2 hunchback 基因的结构
• 1.3.3 hunchback 基因的调控功能
• 1.3.4 hunchback 基因的突变表型
• 1.4 小结
• 1.5 研究目标和整体思路
• 1.5.1 研究目标
• 1.5.2 整体思路
• 1.6 研究内容和技术路线
• 1.6.1 东亚飞蝗hunchback 基因的克隆及序列分析
• 1.6.2 东亚飞蝗hunchback 基因的表达
• 1.6.3 东亚飞蝗hunchback 基因的parental RNAi
• 1.6.4 东亚飞蝗RNAi 效果评价
• 1.7 本研究的创新性
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 溶液配制
• 2.3 东亚飞蝗hunchback 基因克隆
• 2.3.1 hunchback 片段的PCR 扩增、克隆及序列测定
• 2.3.2 3’RACE 和5’RACE 克隆hunchback 基因3’端和5’端cDNA 序列
• 2.4 东亚飞蝗RNAi
• 2.4.1 dsRNA 的合成
• 2.4.2 dsRNA 的注射
• 2.5 东亚飞蝗胚胎制备以及免疫组织化学染色
• 2.5.1 胚胎的收集
• 2.5.2 胚胎制备
• 2.5.3 胚胎免疫组织化学染色
• 2.6 hunchback 基因的Northern Blot 分析
• 2.6.1 胚胎总RNA 的提取
• 2.6.2 Northern 杂交
• 2.7 Hunchback 蛋白的ELISA 检测
• 2.7.1 胚胎总蛋白的提取
• 2.7.2 ELISA
• 3 结果与分析
• 3.1 东亚飞蝗hunchback 基因克隆和分析
• 3.1.1 东亚飞蝗hunchback 基因片段的克隆和分析
• 3.1.2 5’RACE 和3’RACE 克隆hunchback 基因5’端和3’端cDNA 序列
• 3.1.3 东亚飞蝗hunchback 基因的分析
• 3.2 东亚飞蝗胚胎体节模式的形成
• 3.3 hunchback 基因的表达
• 3.4 东亚飞蝗parental RNAi
• 3.4.1 DNA 模板
• 3.4.2 dsRNA 的制备
• 3.4.3 东亚飞蝗parental RNAi
• 3.4.4 parental RNAi 效果的Northern Blot 和ELISA 分析
• 3.4.5 parental RNAi 表型分析
• 3.5 Parental RNAi 影响因素的研究
• 3.5.1 不同注射剂量的影响
• 3.5.2 RNAi 作用的持续性
• 3.5.3 不同长度dsRNA 的影响
• 4 讨论
• 4.1 东亚飞蝗parental RNAi
• 4.1.1 parental RNAi 方法的选择
• 4.1.2 东亚飞蝗parental RNAi 的特异性
• 4.1.3 东亚飞蝗parental RNAi 的高效性
• 4.1.4 东亚飞蝗parental RNAi 作用的持续性
• 4.2 影响东亚飞蝗parental RNAi 的因素
• 4.2.1 注射时间
• 4.2.2 注射剂量
• 4.2.3 dsRNA 的长度
• 4.3 东亚飞蝗parental RNAi 效果的评价
• 4.4 东亚飞蝗RNAi 的应用及展望
• 4.5 东亚飞蝗hunchback 基因的功能
• 4.5.1 hunchback 基因在颌部、胸部的作用
• 4.5.2 hunchback 基因在腹部的作用
• 4.6 hunchback 基因功能的进化
• 4.6.1 hunchback 基因可能在低等昆虫中起着更重要的作用
• 4.6.2 hunchback 基因氮端锌指因子功能的进化
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A 博士期间论文发表情况
• B 用于转录dsRNA 的hunchback 基因片段的同源性比对结果