Al～（3+）、高温对酿酒酵母的胁迫作用及其耐性机制研究

论文题目: Al～（3+）、高温对酿酒酵母的胁迫作用及其耐性机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 金承涛

导师: 朱睦元

关键词: 酿酒酵母,铝毒,氧化作用,耐铝机制,谷胱苷肽,超氧化物歧化酶,海藻糖,耐热机理,热激蛋白

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 环境因子与生命体系相互作用的研究对改善人类的生存、生活与生产都有着重要意义。酵母是一种理想的模式生物,也是一种广泛用于工业生产的生物材料。A1~3+和高温是重要的环境胁迫因子。目前酵母Al毒的机制尚未明晰,特别是具有强氧化作用的Al~3+是否会对酵母造成氧化胁迫还未被揭示,同时胞内GSH、SOD等抗氧化剂以及具有广谱抗逆性作用的海藻糖是否与酵母的耐Al机制相关也未见报道。对于酵母耐热性虽已研究较多,但耐热酵母的耐热机理仍不清楚。因此,本文以酿酒酵母为材料,选取Al~3+和高温两种逆境因子进行实验。研究选用酿酒酵母CY4、CY8(gshl 缺陷株):LK、LT(耐Al突变株):LK、HU-TY-1(耐高温菌株)等三对菌株为主要材料,对酵母Al毒形式及对Al~3+的吸收、Al诱导的ROS及膜脂过氧化水平、GSH、SOD与海藻糖在耐Al机制中的作用以及耐热菌株的热激蛋白表达特征等开展了一系列研究,以进一步阐明Al~3+与高温胁迫对酿酒酵母的作用机理,为相关理论的完善和酵母的遗传改良打下基础。 1.观察了Al对酿酒酵母的毒性形式。实验发现Al~3+处理后,酵母细胞的菌落生长明显受抑制,细胞的相对生长率和生长密度均显著降低:在低浓度(≤500M)Al~3+作用下,对数期明显延长;而在较高浓度(1001μM)Al~3+作用下,细胞基本停止生长,长期处于延滞期。通过FDA-PI染色并在荧光显微镜下观察发现,Al~3+处理后细胞粘连成簇状,死细胞明显增多,特别是新出芽细胞死亡率明显增高。可见酵母细胞对Al非常敏感,毒性形式呈多样化。 2.分析了酵母细胞对Al~3+的吸收特性。结果表明,CY4、CY8菌株在Al~3+处理后都会在胞内积累一定浓度的Al~3+:耐Al性较低的缺陷型菌株CY8的Al~3+吸收值随着处理浓度的提高而提高,且显著高于野生型菌株CY4,其中在501μM Al~3+处理后可高2.1倍;而野生型菌株CY4在不同Al~3+处理后的吸收值则无显著差异。可见Al~3+的吸收积累是造成酵母Al毒的基础,而且吸收值与菌株的耐Al性呈负相关。 3.研究并发现Al对酵母细胞的氧化应激作用。利用特异性荧光探针DCFH-DA(二氯二乙酸酯荧光素)对胞内活性氧(ROS)水平进行了检测。结

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 文献综述

第一节 微生物的铝毒性及抗性机理

1.Al对微生物的毒性

1.1 Al的性质和毒性形式

1.2 Al的跨膜运输

1.3 Al对微生物生长的抑制

1.4 Al的细胞学影响

1.5 Al对生物大分子的影响

2.微生物的耐Al机理

2.1 Al的排出与隔离

2.2 有机酸在耐Al毒害中的作用

2.3 某些金属离子和离子转运蛋白在耐Al毒害中的作用

2.4 特定酶系统在耐Al毒害中的作用

2.5 其它螯合作用在耐Al毒害中的作用

2.6 其它耐Al机制

第二节 热激蛋白与生物耐热性

1.热激蛋白

1.1 热激蛋白的分类及分布

1.2 热激蛋白的物化特性

2.热激蛋白的产生及调控机制

2.1 HSF的种类

2.2 HSF的结构

2.3 HSF调节的HS基因的转录

2.4 HSP翻译水平的调节

3.热激蛋白在生物热休克应答中的作用

3.1 HSP70家族的作用

3.2 其它HSP家族的作用

4.与生物耐热性相关的其它因子

第二章 Al~(3+)对酵母的氧化毒性及酵母的抗性机制研究

1.前言

2.材料与方法

2.1 菌株

2.2 培养基

2.3 酿酒酵母细胞在Al作用下的生长情况检测

2.3.1 酵母菌株在Al作用下的生长量测定

2.3.2 酵母菌株在Al作用下的相对生长率测定

2.3.3 酵母细胞在Al作用后的FDA-PI染色观察

2.3.4 酵母细胞在Al作用下的菌落生长情况观察

2.4 酵母细胞Al~(3+)吸收情况分析

2.5 酵母细胞在Al作用下的ROS水平测定

2.5.1 胞内蛋白质浓度测定

2.5.2 Al处理后胞内ROS水平测定

2.6 Al作用下酵母细胞的膜脂过氧化测定

2.7 Al作用后酵母菌株呼吸缺陷型的检出

2.8 酵母菌株Al作用后胞内还原型谷胱苷肽(GSH)含量检测

2.9 RT-PCR分析Al作用下GSH合成相关基因的转录水平

2.10 酵母细胞内GSH含量改变后的耐Al能力分析

2.10.1 GSH表达增强或抑制后酵母细胞在Al作用下的存活率测定

2.10.2 GSH表达增强抑制后酵母细胞在Al作用下的菌落生长情况观察

2.11 酵母细胞Al处理后的胞内SOD酶活性测定

2.12 数据统计分析

3.结果

3.1 Al对酿酒酵母细胞生长的毒性作用

3.2 酵母细胞对Al~(3+)的吸收情况

3.3 酵母细胞在Al胁迫下ROS水平的变化

3.4 Al胁迫下酵母细胞的膜脂过氧化水平

3.5 酵母菌株在Al胁迫下呼吸缺陷型的检出频率

3.6 酵母菌株在Al胁迫下胞内还原型谷胱苷肽(GSH)含量变化

3.7 Al胁迫后酵母GSH合成相关基因GSH1、YAP1转录水平的变化

3.8 酵母胞内GSH合成受抑制(增强)后细胞耐Al性的变化

3.9 酵母细胞Al胁迫后的胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性变化

4.讨论

4.1 酵母Al毒的表现及对Al~(3+)的吸收特性

4.2 Al对酵母细胞的氧化胁迫作用

4.3 酵母在Al作用下的抗氧化机制

5.结论

第三章 耐Al酵母菌株的分离和海藻糖对Al耐性的作用研究

1.前言

2.材料与方法

2.1 菌株

2.2 培养基

2.3 耐Al酵母菌株LT的诱变筛选

2.4 酿酒酵母突变株LT和亲株LK的生长曲线测定

2.5 酵母突变株LT和亲株LK在Al胁迫下的生长测定

2.5.1 Al胁迫下相对生长率测定

2.5.2 Al胁迫下平板菌落生长情况观察

2.6 两种菌株的超微弱发光情况检测

2.7 酵母菌株经Al胁迫后的胞内海藻糖测定

2.8 酵母菌株经温和热处理后的海藻糖含量与耐Al性测定

2.9 酵母菌株稳定期时的海藻糖含量与耐Al性测定

2.10 数据统计分析

3.结果

3.1 耐Al酵母突变株LT的获得

3.2 突变株LT和亲株LK在Al胁迫下的生长特性

3.3 两种菌株的超微弱发光强度差异

3.4 酵母菌株在Al应激下的胞内海藻糖积累

3.5 温和热诱导后酵母细胞的海藻糖积累及耐Al性变化

3.6 酵母细胞在稳定期时的海藻糖积累及耐Al性变化

4.讨论

4.1 酵母突变株LK具有较强的耐Al性和相应的物化特性

4.2 海藻糖的积累与酵母细胞的耐Al作用紧密相关

5 结论

第四章 耐热酵母菌株的耐热机制研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 菌株

2.2 培养基

2.3 酵母细胞高温处理后的存活率测定

2.4 酵母菌株的发酵力测定

2.5 酵母细胞经温和热诱导后的耐热性测定

2.6 胞内蛋白提取、SDS-PAGE及Western-blot分析

2.6.1 电泳样品的制备

2.6.2 SDS-PAGE凝胶电泳

2.6.3 Western-blot分析

2.7 其它逆境因子作用后酵母的耐热性检测

2.7.1 在不同葡萄糖含量的培养基中生长时的耐热性测定

2.7.2 在不同pH条件下培养时的耐热性测定

2.7.3 温和浓度H_2O_2作用后的耐热性测定

2.7.4 温和浓度乙醇诱导后的耐热性测定

2.8 数据统计分析

3.结果

3.1 两种菌株热处理后的存活率差异

3.2 两种菌株的耐高温发酵力差异

3.3 酵母菌株经温和热诱导后的耐热性变化

3.4 两种酵母菌株在热休克应答前后的蛋白图谱差异

3.5 菌株单倍体子代的耐热性及蛋白表达特征

3.6 其它逆境因子胁迫对酵母耐热性的影响

4.讨论

4.1 以HSP70合成为标志的热休克应答反应与酿酒酵母的诱导耐热性密切相关

4.2 HSP70的组成性表达与HU-TY-1菌株具有较高的固有耐热性密切相关

4.3 不同逆境因子诱导的应激反应间存在一定的互通性

5.结论

参考文献

在读期间参加的主要科研项目及发表的论文

致谢

发布时间: 2005-10-10

参考文献

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