论文摘要
目的研究牛膝多肽（Achyranthes bidentata Blum Polypeptides,ABPP）对体外培养的大鼠海马神经元突起生长的促进作用及其对GAP-43和NF-H基因表达的影响,以及与ERK1/2信号转导通路的关系。研究ABPP诱导PC12细胞神经元性分化的作用,初步探讨ABPP对PC12细胞的ERK1/2信号转导途径的影响。观察ABPP对小鼠坐骨神经夹伤后神经再生的影响。方法1.以体外原代培养的胎鼠海马神经元为研究模型,通过MTT检测ABPP对海马神经元细胞活性的影响,通过免疫荧光细胞化学法,采用Image-Pro Express软件测量不同浓度ABPP（0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml）加药24 h,对海马神经元神经突起生长的影响;通过实时荧光定量PCR法定量分析不同浓度ABPP加药6 h,对海马神经元GAP-43和NF-H基因表达的影响。同时应用ERK特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养海马神经元分析ABPP对海马神经元的作用与ERK1/2信号转导通路的关系。2.以PC12细胞为研究模型,观察在低血清的情况下不同浓度ABPP（0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml）诱导PC12细胞发生的形态学改变,第7 d和第14 d时分别观察细胞分化的形态学改变。通用免疫荧光细胞化学法,观察NF-H在ABPP诱导分化的PC12细胞中的表达,从而鉴定ABPP诱导的分化细胞;为了研究与ABPP促分化有关的信号转导通路,采用Western blotting法观察不同浓度ABPP加药不同作用时间后对低血清培养的PC12细胞ERK活性的影响,同时应用ERK特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养PC12细胞,分析ERK1/2信号转导通路在ABPP对PC12细胞影响中的作用。3.ICR小鼠50只,雌雄各半,行左侧坐骨神经夹伤术。术后随机分为5组:ABPP低、中、高剂量组（剂量分别为1,4,16 mg/kg）,弥可保组（阳性对照,剂量为65μg/kg）及生理盐水组（空白对照,给予等体积生理盐水）。经尾静脉注射给药,每日一次,连续给药21 d。术后定期做足迹试验,损伤后3周记录复合肌动作电位,计算运动神经传导速度;取损伤远端5mm处坐骨神经,进行免疫组织化学染色及透射电镜观察,测定再生神经纤维密度、再生神经纤维直径和髓鞘厚度;取腓肠肌做石蜡切片,染色后测定肌纤维横截面积。结果1.MTT结果显示在0.01到10μg/ml范围内,ABPP对海马神经元没有明显毒性。不同浓度ABPP（0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml）加药24 h,海马神经元神经突起长度明显增加,存在时间依赖性和剂量反应关系,加药24 h后作用最强,剂量为1μg/ml时作用最佳。ABPP（0.5μg/ml、1.0μg/ml）培养6 h后,海马神经元的GAP-43和NF-H的mRNA表达量与阴性对照组相比是明显升高的。PD98059抑制了ABPP（0.5μg/ml）对海马神经元突起的生长,同时降低了NF-H和GAP-43基因mRNA和蛋白质的表达。并且ABPP促神经生长的作用可能是通过ERK通路产生的。2.ABPP处理PC12细胞3 d后,部分PC12细胞开始出现神经元样的形态:细胞胞体的皱缩、平展以及可见有明显的类似于神经元突起的生长,细胞停止增殖。随着加药时间延长具有神经元样的细胞逐渐增多,到第7 d时,NGF和ABPP处理组PC12细胞的突起都显著增多,能形成网络;到第14 d时,这种现象愈发显著。加药后第7 d和第14 d,ABPP各浓度组的细胞分化率以及细胞突起长度均明显提高,且存在明显的剂量反应关系。加药第7 d和第14 d,ABPP高剂量组与NGF组的PC12细胞均出现NF-H标记阳性的分化细胞。ABPP在0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml剂量范围内作用于低血清培养的PC12细胞2 d,对ERK1/2的激活作用存在明显的剂量反应关系,以1.0mg/ml者作用为最大。当用PD98059抑制MEK1/2的活化时,ABPP对ERK1/2的激活作用被部分阻断。3.ABPP对小鼠坐骨神经夹伤后的神经功能恢复有促进作用,对SFI的改善存在剂量反应关系。能提高损伤后神经近、远端复合肌动作电位幅度和运动神经动作电位,再生髓鞘的密度、厚度、轴突直径及腓肠肌肌纤维横截面积,均显著优于空白对照组,超微结构观察显示,ABPP组小鼠坐骨神经夹伤段有髓神经纤维的髓鞘形态、厚度及成熟度均优于对照组。结论1.ABPP能促进体外培养的海马神经元神经突起的生长,其作用与GAP-43和NF-H基因表达的升高相关,可能是通过ERK1/2信号转导途径实现的。2.ABPP具有诱导PC12细胞神经元性分化的作用,该作用可能是通过ERK1/2信号转导途径实现的。3.ABPP能促进小鼠坐骨神经夹伤后的神经再生和功能恢复。
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