乙型肝炎病毒突变型表面抗原在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及其免疫活性研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）是严重危害人类公共健康的世界性问题。在我国,HBV携带者约占人口总数的10%,现患慢性乙型肝炎约3000万人。HBV的感染不仅能够引起急、慢性病毒性肝炎,而且部分感染者会发生肝硬化和肝细胞癌。病毒的基因变异与逃避机体免疫应答、出现耐药性、改变致病性和引起疾病流行等密切相关,研究病毒的基因变异对防治HBV感染有重要意义。乙型肝炎病毒S基因编码的HBsAg是当前乙肝疫苗的主要成分,也是HBV感染诊断的重要依据。抗-HBs抗体可用来预防肝移植后HBV的再感染和母婴垂直感染,但这有赖于HBsAg与抗-HBs抗体之间的相互作用。当HBsAg抗原性发生改变可直接影响HBV感染后的诊断和治疗。目前所知,S基因突变发生率最高的部位是表面抗原中第145位氨基酸（基因m587G→A）的甘氨酸→精氨酸的突变（G145R）。这种新的变异株可导致疫苗免疫失败、肝脏移植后HBV再感染和母婴垂直传播等,给乙肝防治带来了新的问题。现有HBsAg诊断试剂对G145R突变株感染病例的灵敏度不高,经常会有漏检案例导致误诊和血源性HBV传播。本论文研究从一份献血员血清中分离到一株G145R突变的HBV病毒X119,设计S区引物从中扩增出S基因,利用杆状病毒表达系统进行变异型表面抗原（119s）的大规模表达。通过液相色谱和CsCl平衡梯度离心等手段对目的蛋白进行纯化,获得纯化的119s经透射电镜观察证明其可自发组装成病毒样颗粒。为考察表达的重组抗原的免疫原性,本研究用纯化后的119s抗原免疫小鼠,结果经119s免疫的小鼠产生了针对119s强烈的特异性免疫应答,而阴性对照组则无特异抗体产生,证明颗粒性的119s蛋白具有良好的免疫原性,可见重组杆状病毒表达系统表达生产的突变型sAg有望作为新乙肝疫苗的组成成分以提供对G145R突变株的保护。对纯化蛋白的抗原性分析发现其与野生型sAg对构象型单抗反应性差异显著,表明两者在构象上有很大不同,导致其对部分现有检测试剂的敏感度不高而易被漏检,利用基因工程重组抗原作为开发新检测试剂的筛选原料有望提高检测试剂对突变型HBV的检出率。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 一.乙型肝炎病毒研究进展
• 1 HBV的形态及理化性质
• 2 HBV的基因组和主要功能蛋白
• 3 HBV的变异性及分子进化
• 4 乙型肝炎的诊断
• 5 乙型肝炎疫苗的研制
• 二.昆虫细胞杆状病毒表达载体系统
• 1 杆状病毒的生物学特性
• 2 杆状病毒表达系统的研究进展
• 三.本论文研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 一.材料
• 1 主要仪器
• 2 主要试剂和材料
• 3 常用溶液及培养基配制
• 二.方法
• 1 基因克隆的构建
• 2 昆虫细胞培养和重组杆状病毒的生产
• 3 重组蛋白质的表达和纯化
• 4 免疫实验
• 5 计算机辅助设计与分析
• 第三章 结果与分析
• 一.突变型HBV表面抗原（119s）的表达
• 1 重组杆状病毒Bv-119s的构建和生产
• 2 重组蛋白在悬浮Sf-21细胞中的小量表达实验
• 3 利用细胞发酵系统进行目的蛋白的表达
• 二.突变型HBV重组抗原（119s）的纯化
• 1 119s的溶解
• 2 阴离子交换作用层析
• 3 疏水作用层析
• 4 氯化铯平衡梯度离心
• 5 电镜观察
• 三.重组突变型HBV表面抗原（119s）的免疫活性分析
• 1 119s纯化蛋白对抗HBsAg单抗的反应性分析
• 2 119s蛋白免疫原性分析
• 第四章 讨论
• 1 表面抗原突变株对乙肝防治的影响
• 2 重组乙肝疫苗的免疫保护性评价
• 3 昆虫细胞大规模发酵培养
• 4 119s蛋白的纯化探索
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在校期间发表的论文