木霉内切葡聚糖苷酶（EG）分子定向进化的研究

论文摘要

纤维素是生物界最重要的碳源物质，每年由光合作用产生的植物干质量中纤维素就占一半。一直由于缺乏有效的处理手段，纤维素资源成为了极大的资源浪费。纤维素通过纤维素复合酶处理后可以有效降解而成为可利用产物如葡萄糖和乙醇等。内切葡聚糖苷酶（endoglucanase，简称EG）是纤维素复合酶中的重要组成部分，能把难降解的纤维素降解为易处理的非还原性末端小分子纤维素，在纤维素能源工程中占据着重要的位置。寻找纤维素的有效转化途径，有效利用大量浪费的纤维素资源，将纤维素降解为可利用能源，是本研究的最终目的。内切葡聚糖苷酶的研究，对于有效利用纤维素，解决纤维素浪费或污染，提供生物能源有很大的实用和应用前景。DNA改组技术从1994年问世以来，逐渐成熟和完善。国外已有大量成功利用DNA改组技术对纤维素酶分子进行改良的的例子。Matsumura I等于1999年经三轮突变、DNA改组和筛选，获得了对多聚甲醛或福尔马林处理耐性显著提高的β-葡糖苷酸酶突变体；Furukawa K等于2000年通过DNA改组建立了一个突变库并与细菌表面展示系统融合，用于羧甲基纤维素酶基因酶活性克隆的筛选；Kumamaru T等于2001年将大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因经过3轮DNA改组后，得到对β-半乳糖苷的催化降解能力提高500倍的新基因。随着对Endoglucanase研究的深入和酶嵌合多样性细菌文库、生物信息学、计算机辅助药物设计等技术的应用，纤维素酶理论基础研究，相信在国家能源和环境污染处理将会发挥更重大的作用。质粒pASKint100是一个原核展示系统，利用外源蛋白与外膜蛋白intimin相融合展示于细菌表面，其宿主为大肠杆菌K12系列。质粒为德国教授AndreasChristmann的馈赠。A．Christmann等做了大量实验，已成功将外源片段整合到质粒中，并利用灵敏的荧光免疫检测技术检测到。利用原核展示系统展示多肽和酶，已有大量的应用实例（详见序论综述），十分成熟，具有产量高、成本低、再生能力强，与胞内表达的酶相比，避免了使酶释放破膜过程，减少酶分子的损失，催化效率更高。质粒的相关性质见图1.目前用于生产纤维素酶的微生物大多为真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属和根霉属，其中丝状真菌木霉（Trichoderma．sp）是公认产纤维素酶最高的菌种之一。本研究采用的产内切葡聚糖苷酶菌为里氏木霉和康宁木霉。本研究利用生物信息学技术对欲改组的木霉内切葡聚糖苷酶序列进行了同源序列比对、进化树、分子二级结构和三级结构等分析，从另一个角度探索了内切葡聚糖苷酶的活性位点、结构域，对内切葡聚糖苷酶认识更深一步，进而寻找内切葡聚糖苷酶的可利用性。在此基础上，利用体外分子进化手段-DNA改组对内切葡聚糖苷酶从基因水平进行改造，通过产生大量的有益突变嵌合体和高效的筛选手段获得理想的纤维素酶突变子，在酶活性和酶稳定性方面希望获得改进，同时借助于细菌展示系统，将酶分子展示在细菌表面，期望能有效提高微生物的纤维素降解能力。研究中主要采用方法：Clustalx等生物信息学软件对EG序列进行生物信息分析、经典DNA改组技术、交错延伸改组技术和RT-PCR法等。主要研究结果：两种木霉的EG酶催化降解纤维素时，关键氮基酸为两个Glu；一些芳香族氨基酸在与纤维素结合中起重要作用；一些氨基酸酰胺基团在EG酶降解纤维素中起着重要的电子传递作用；两种木霉的EG酶都有特殊的三维催化域和结合域，有信号肽；所制得木霉RNA的28S和18S条带清晰，其0D260／280在2．0附近，可用于下游操作；反转录获得T．r和T．k的PCR纯化产物，经测序鉴定为EG基因；质粒pASKint100转化到大肠杆菌中，双酶切去磷酸化后得到约2ug产物；运用两种DNA改组技术对EG进行了改组，电泳图上在EG片段大小（约800bp）处有清晰条带；改组片段转化到大肠杆菌后，经质粒提取，然后Nael酶切鉴定，证实外源片段与质粒pASKint100的连接。最后经查阅资料和实验分析得出以下结论：生物信息分析技术对实验工作有指导和辅助作用；EG家族都有相类似的三维结构和催化机理；利用生物信息结果，设计引物反转录所获的产物，经测序鉴定确为EG序列，证实生信分析理论和实验工作相结合的重要性；EG序列经两种DNA改组技术（经典改组和交错延伸改组）处理后，其序列重新被组装，证实DNA改组技术可改变片段一级结构；EG片段与原核展示系统pASKint100连接后，展示于细菌表面，但未显示显著的生物活性，可能原核展示系统限制了EG展示酶的正确折叠。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题的研究背景和目的
• 1.1.1 课题研究背景
• 1.1.2 课题研究目的
• 1.2 课题的研究内容和意义
• 1.2.1 课题研究内容
• 1.2.2 课题研究意义
• 1.3 论文主要内容和组织
• 第2章 内切葡聚糖苷酶的生物信息分析
• 2.1 引言
• 2.2 生物信息分析所用到的软件
• 2.2.1 Clustalx（1.81）多序列比对
• 2.2.2 SignalP3.0信号肽预测
• 2.2.3 二级结构预测
• 2.2.4 SWISS-MODEL三级结构预测
• 2.3 EG序列的生物信息分析结果
• 2.3.1 EG的Clustalx多序列比对分析
• 2.3.2 EG序列信号肽预测
• 2.3.3 三条EG序列的二级结构比较
• 2.3.4 三条EG序列的三级结构比较
• 2.3.5 小结
• 第3章 内切葡聚糖苷酶分子的改组研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要试剂配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 木霉培养
• 3.3.2 木霉RNA提取
• 3.3.3 PCR循环
• 3.3.4 质粒pASKint100提取
• 3.3.5 氯化钙法大量制备大肠杆菌ER2738感受态细胞
• 3.3.6 化学法转化
• 3.3.7 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 3.3.8 DNA回收方法
• 3.3.9 DNA改组
• 3.3.10 连接反应
• 3.3.11 利用CMC板检测EG活性
• 3.3.12 序列测定和分析
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 木霉RNA的提取
• 3.4.2 EG序列的获得
• 3.4.3 质粒pASKint100的提取与鉴定
• 3.4.4 EG序列DNA改组进化策略的研究
• 3.4.5 重组克隆的构建
• 3.4.6 CMC板检测克隆的EG活性
• 3.5 讨论
• 结论
• 综述
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 个人简历