香菇纤维素酶基因exgl的克隆及其表达

论文摘要

我国是一个饲料资源十分紧张的国家,土地少、人口多,人畜争粮的矛盾十分突出。要保持我国饲料工业和畜牧业的持续发展,必须解决好饲料问题,否则将严重制约其发展。纤维素是植物光合作用的主要多糖类产物,由800-1200个葡萄糖分子聚合而成,是地球上最廉价、最丰富的可再生资源。全世界每年的植物体生成高达1500亿吨干物质,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨,但都被很少利用。因此,成功开发这一潜在饲料资源显得尤为迫切和重要。纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,它是一类复杂的复合物,称之为纤维素酶系,通常分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。近年来,随着分子生物学的飞速发展,通过基因工程途径,构建生产纤维素酶的高效基因工程菌已经成为研究的热点。本研究通过RT-PCR技术,从亚洲香菇中克隆出香菇纤维素酶基因exgl,并分析了该基因的序列,构建了原核表达载体,通过SDS-PAGE对该基因表达的蛋白产物进行了分析,用CMC-Na法定性检测了重组菌产生的纤维素酶的活力。本研究主要取得了以下结果：1.采用RT-PCR技术,从香菇的cDNA中分离出大小约1537bPexgl的片段。2.利用载体pET-28a,构建原核表达载体pET-28a-exgl。验证分析表明,所克隆的exgl基因已置于表达载体的正确阅读密码框下。3.包含pET-28a-exgl重组菌经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,蛋白的分子量大约为57kDa,通过与葡聚糖水解酶家族5（glycosyl hydrolase family 5）的蛋白比对,同源性达94.9%；用CMC-Na法检测重组菌产生的蛋白有活力,结果显不pET-28a-exgl重组菌最佳诱导时间为3h。4.利用载体pPIC9K,构建真核表达载体pPIC9K-exgl。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 纤维素酶综述
• 1.1.1 纤维素酶的组成
• 1.1.2 纤维素酶的分子结构
• 1.1.3 纤维素酶的来源
• 1.1.4 纤维素酶的作用机理
• 1.1.5 纤维素酶的基因克隆
• 1.1.6 表达系统的选择
• 1.1.7 纤维素酶的应用
• 1.2 研究目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 香菇纤维素酶exg1基因的克隆
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂及试剂盒
• 2.1.4 主要培养基及溶液的配制
• 2.1.5 引物设计与合成
• 2.1.6 香菇总RNA的提取
• 2.1.7 反转录反应
• 2.1.8 RT-PCR
• 2.1.9 PCR产物的扩增
• 2.1.10 PCR产物割胶回收
• 2.1.11 将回收的DNA加"A"
• 2.1.12 将加"A"的DNA纯化
• 2.1.13 将目的片段连接到pMD19-T载体,构建pMD19-T-exg1
• 2.1.14 E.coli感受态细胞的制备
• 2.1.15 E.coli感受态细胞的转化
• 2.1.16 E.coli中pMD19-T-exg1的提取
• 2.2 香菇纤维素酶exg1基因在大肠杆菌中表达
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 主要试剂及试剂盒
• 2.2.3 主要溶液的配制
• 2.2.4 表达载体pET-28a-exg1的构建
• 2.2.5 碱裂解法提取pET-28a-exg1
• 2.2.6 表达载体pET-28a-exg1双酶切鉴定
• 2.2.7 BL21感受态细胞的制备
• 2.2.8 BL21感受态细胞的转化
• 2.2.9 重组基因的诱导表达
• 2.2.10 表达产物SDS-PAGE检测
• 2.2.11 表达产物酶活检测
• 2.3 香菇纤维素酶exg1基因在毕赤酵母中表达
• 2.3.1 菌株与质粒
• 2.3.2 主要培养基和溶液的配制
• 2.3.3 表达载体pPIC9K-exg1的构建
• 2.3.4 碱裂解法提取pPIC9K-exg1
• 2.3.5 表达载体pPIC9K-exg1双酶切鉴定
• 2.3.6 毕赤酵母感受态细胞的制备
• 2.3.7 毕赤酵母感受态细胞的转化
• 3 结果和分析
• 3.1 香菇总RNA电泳分析
• 3.2 香菇纤维素酶基因exg1的克隆
• 3.3 香菇纤维素酶基因exg1测序结果
• 3.4 香菇纤维素酶基因exg1原核表达载体的构建
• 3.5 重组pET-28a-exg1诱导产物的SDS-PAGE检测
• 3.6 重组pET-28a-exg1的刚果红平板检测
• 3.7 香菇纤维素酶基因exg1酵母表达载体的构建
• 4 讨论
• 4.1 提取香菇总RNA的注意事项
• 4.2 退火温度对PCR结果的影响
• 4.3 测序结果的分析
• 4.4 转化效率的影响因素
• 4.5 酶活的测定
• 4.6 exg1基因在毕赤酵母中表达不成功的原因
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式