丁酸梭菌培养与发酵动力学以及调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的研究

论文摘要

本论文从丁酸梭菌的菌体形态、生理生化和16S rRNA序列分析菌种鉴定开始,在此基础上,系统研究了丁酸梭菌培养条件的优化,并建立了丁酸梭菌分批发酵和补料分批发酵的动力学模型;另外,在体外研究了丁酸梭菌的耐酸、耐胆汁特性,并在体内研究了丁酸梭菌和青春双歧杆菌、粪肠球菌混菌调节抗生素引起的腹泻小鼠肠道菌群平衡的作用。论文的主要研究结果如下: 利用伯杰氏细菌分类鉴定系统和16S rRNA序列分析的鉴定方法对实验室保存的丁酸梭菌进行鉴定,通过设计引物并将扩增出的16S rRNA序列在National Center Biotechnology Information（NCBI）上使用BLASTN程序进行比对,尝试了一种丁酸梭菌分子鉴定的快速、准确方法: 研究了丁酸梭菌的耐酸、耐胆汁特性,通过和其它几种常用益生菌体外实验的比较,证明丁酸梭菌比乳杆菌、肠球菌、双歧杆菌更耐酸、更耐胆汁浓度,这个结论表明了丁酸梭菌更能耐受肠道环境、能在肠道停留更长时间,具有很好的应用价值; 利用响应面实验设计的科学方法对丁酸梭菌的培养条件进行系统优化,最终确定培养丁酸梭菌的种子培养基为:2.44%葡萄糖（w/v）,2.08%酵母浸膏（w/v）,1%胰蛋白胨（w/v）,0.1%（NH4）2SO4（w/v）,0.1%NaHCO3（w/v）,0.02%MnSO4·H2O（w/v）,0.02%MgSO4·7H2O（w/v）,0.002%CaCl2（w/v）和2%琼脂（w/v）（配固体培养基时用）,初始pH为8.55,丁酸梭菌在此培养基中厌氧培养24小时后活菌数可达1.03×109CFU/mL:培养丁酸梭菌的发酵培养基为:2%葡萄糖（w/v）,3.98%豆饼粉提取液,0.1%（NH4）2SO4（w/v）,0.124%NaHCO3（w/v）,0.37%玉米浆（w/v）,0.02%MnSO4·H2O（w/v）,0.02%MgSO4·7H2O（w/v）,0.002%CaCl2（w/v）和2%琼脂（w/v）（配固体培养基时用）,初始pH为7.5,丁酸梭菌在此培养基中厌氧培养24小时后活菌数可达7.1×108CFU/mL,筛选出合适的培养基配方,为下步的研究以及今后大规模的生产提供依据; 首次考察了丁酸梭菌在5 L发酵罐中自然分批发酵动力学过程,并建立了相关模型,实验中采用Logistic方程描述了菌体生长的动力学过程,采用Leudeking-Piret方程描述了产物合成的动力学过程,用Leudeking-Piret-Like方程描述了底物消耗的动力学过程,从检验结果可知,模型可以较好的（尤其在发酵的前20小时内）解释实际发酵中细胞生长、底物利用和产物合成的动力学规律。所得模型方程如下: 细胞生长模型:（dx）/（dt）=0.1812（1-x/1.64）x 底物消耗模型:-（dS）/（dt）=9.0603（dx）/（dt）+0.00967x 产物合成模型:（dP）/（dt）=3.17（dx）/（dt）+0.00175x;

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 正常微生物群的概念、构成及生理功能
• 1.1.1 正常微生物群的概念
• 1.1.2 正常微生物群的构成
• 1.1.3 正常微生物群与宿主的关系
• 1.1.4 正常微生物群的生理功能
• 1.1.5 微生态平衡和失调
• 1.2 微生态学理论和益生菌的生理作用
• 1.2.1 微生态学理论
• 1.2.2 益生菌的生理作用
• 1.3 重要益生菌及其制品
• 1.3.1 重要益生菌
• 1.3.2 人用益生菌制品
• 1.3.3 畜牧、水产、植物及其他用益生菌制品
• 1.4 丁酸梭菌（Clostridium butyricum）
• 1.4.1 丁酸梭菌的特征
• 1.4.2 丁酸梭菌的生理作用
• 1.4.3 丁酸梭菌生产丁酸
• 1.4.4 丁酸梭菌生物转化生成1，3-丙二醇
• 1.5 益生菌的潜在危害
• 1.5.1 益生菌可能产生条件性感染
• 1.5.2 益生菌可能产生炎症
• 1.5.3 益生菌可能会转移抗抗生素基因
• 1.6 益生菌的前景展望
• 1.7 选题背景及研究内容
• 1.7.1 选题背景
• 1.7.2 研究内容
• 第二章 丁酸梭菌的鉴定及与其它益生菌耐酸、耐胆汁特性比较研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 厌氧培养方法
• 2.1.4 菌株的系统分类鉴定
• 2.1.5 耐酸、耐胆汁特性实验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 丁酸梭菌的鉴定结果
• 2.2.2 耐酸特性
• 2.2.3 耐胆汁特性
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 丁酸梭菌培养基优化研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 初始培养基
• 3.1.3 丁酸梭菌的培养和计数
• 3.1.4 实验设计
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 碳源、氮源、无机盐等培养基成分的选择
• 3.2.2 种子培养基的优化
• 3.2.3 发酵培养基的优化研究
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 丁酸梭菌的分批发酵及其动力学的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 分批发酵动力学模型
• 4.1.4 中试放大
• 4.1.5 pH对分批发酵的影响
• 4.1.6 测定方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 分批发酵动力学模型
• 4.2.2 70L中试发酵罐扩大实验
• 4.2.3 pH对分批发酵的影响
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 丁酸梭菌的补料分批发酵及其动力学的研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 发酵条件
• 5.1.4 间歇补料和连续补料分批发酵
• 5.1.5 补料分批发酵动力学
• 5.1.6 测定方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 间歇补料分批发酵和连续补料分批发酵
• 5.2.2 补料分批发酵的优化及其动力学
• 5.3 小结与讨论
• 第六章 丁酸梭菌、青春双歧杆菌和粪肠球菌混菌分批发酵初步研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 混合发酵方法
• 6.1.4 测定方法
• 6.2 结果与分析
• 6.3 小结与讨论
• 第七章 安全性以及调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的研究
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 真空冷冻干燥保护剂的选择
• 7.1.2 急性毒理和Ames试验
• 7.1.3 调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的研究
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 真空冷冻干燥保护剂的选择
• 7.2.2 急性毒理实验
• 7.2.3 Ames试验
• 7.2.4 调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的研究
• 7.3 小结与讨论
• 第八章 主要结论与后续研究展望
• 8.1 主要结论
• 8.2 后续研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附：个人简介及攻读博士学位期间发表的论文