论文摘要
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。块茎是马铃薯的繁殖器官,也是产品器官。研究马铃薯块茎形成的调控机制,不仅具有理论价值,而且对马铃薯的产量提高具有指导意义。马铃薯块茎形成是一个复杂的生物学过程,并受内在因素及外界因素的调控。最近,有报道将拟南芥的AtCO基因导入马铃薯,在短日照条件下,AtCO过表达可以导致块茎形成减少,说明AtCO对块茎的形成有负调节作用。但是其调控块茎形成机制以及内源CO在块茎形成中作用仍不清楚。为了揭示CO在马铃薯块茎形成中的作用,本文克隆了马铃薯StCOL、StTFL1和StLFY基因,并通过构建StCOL反义抑制和StTFL1过表达转基因植株,初步分析了StCOL和StTFL1对块茎形成的作用。主要研究结果如下：1.克隆了一个马铃薯StCOL cDNA序列（DQ882684）、基因组DNA序列及其启动子。该基因由一个内含子和两个外显子构成,StCOL cDNA序列含有一个1083 bp的开放阅读框,编码一个360个氨基酸残基构成的蛋白质分子,StCOL分子量为39.21 kD,等电点为5.09。采用DNAMAN对StCOL和其他同源蛋白的氨基酸序列比对,结果表明StCOL氨基酸序列与拟南芥的AtCO. AtCOL、AtCOL2和AtCOL3的氨基酸序列具有较高的一致性,在N-和C-末端分别具有保守的B-box和CCT结构域,在蛋白C-末端有一保守的7肽序列（YGVVPSF）；系统进化分析结果表明StCOL与豌豆PsCOLb及拟南芥AtCOL3分子的亲缘关系最近；StCOL基因启动子序列上游有8个TATA-box、4个CAAT-box、1个I-box、4个GATA-box等多个顺式作用元件。采用半定量RT-PCR方法对StCOL mRNA水平分析结果显示,StCOL在马铃薯的根、茎、叶、顶芽、花芽和花中都有表达,其中在叶片中的表达水平最高；对块茎形成过程中该基因的表达分析结果显示,在块茎形成不同时期都有StCOL表达,在块茎形成后期表达水平较弱,在成熟块茎中检测不到该基因的表达。另外,体外微型薯的暗诱导过程中该基因持续表达,但该基因的表达水平不受蔗糖和赤霉素的影响。2.采用RT-PCR和RACE的方法克隆了马铃薯StTFL1 cDNA序列（DQ307621）。StTFL1 cDNA序列含有一个528 bp的开放阅读框,编码一个由175个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白分子量为19.86 kD,等电点为8.73,66～88位氨基酸间具有PEBP蛋白典型的特征结构,采用DNAMAN软件对StTFL1和其他同源蛋白的氨基酸序列比对,结果表明StTFL1和拟南芥TFL1、水稻CEN及烟草CEN在氨基酸水平有较高的一致性,而且拟南芥的TFL1和马铃薯的TFL1的二级结构基本一样。采用半定量RT-PCR方法对不同组织中该基因的表达水平检测结果显示,StTFL1基因在马铃薯的根、茎、叶、顶芽和花芽中均表达,其中在根中的表达水平最高；另外,发现在块茎形成的不同时期StTFL1都表达,尤其在匍匐茎形成时有高水平的表达。3.采用RT-PCR和RACE的方法克隆了马铃薯StLFY cDNA序列（EF062357）及基因组DNA序列（EU371047）。该基因由三个外显子和两个内含子组成,StLFY cDNA含有一个1257 bp的开放阅读框,编码一个由418个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白分子量为46.37 kD,等电点为6.18。采用DNAMAN软件对StLFY和其他同源蛋白的氨基酸序列比对,结果表明StLFY和AtLFY、NtFL2及SILFY在氨基酸水平有较高的一致性,而且在氨基末端都有一个保守的富含脯氨酸的区域。半定量RT-PCR分析结果显示,StLFY仅在马铃薯顶芽和花芽有较弱的表达,而且在匍匐茎初始形成时也有较弱表达。4.为了进一步了解StCOL和StTFL1与马铃薯块茎形成的关系,首先优化了一简便的农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化方法：茎段外植体暗中预培养2d,农杆菌侵染5～8 min,暗中共培养时间为2d,转入愈伤诱导和芽分化的培养基（MS+0.5 mg/LTDZ+0.3 mg/L GA3+50mg/L Kan+200 mg/L Car+200 mg/L Cef）,光照培养4～5周即有不定芽的生成。采用PCR方法验证转基因植株,转化率约为5%。在此基础上,进行了StCO L和StTFL1基因的遗传转化,初步对StCO L和StTFL1在块茎形成中的作用以及它们之间的关系进行了分析。短日照条件下,与未转化对照组相比,表达StCOL反义片段的转基因株系叶片中StCOL mRNA水平下降,植株形成块茎个体总数增加,此结果表明StCO L对块茎的形成有负调节作用；过表达StTFL1转基因株系叶片中StTFL1 mRNA水平和形成的块茎个数均增加,表明StTFL1对块茎的形成有促进作用；分别对StCOL反义抑制和StTFL1过表达转基因植株中的StTFL1和StCOL转录表达分析,结果显示,StTFL1是StCOL的下游基因。