tat蛋白提高HIV-1疫苗免疫水平的研究

论文摘要

DNA 疫苗研究的一个重要任务是如何能更好地提高DNA 疫苗的体液免疫和细胞免疫。近年来的研究显示,HIV 的转录活化因子—Tat 蛋白具有自由通过细胞质膜的特性。现已有不少借助Tat 蛋白的穿膜活性将其它蛋白或DNA 成功导入活细胞内的报道。根据大量文献提供的理论基础设计了实验,将tat 与gag/pol 融合表达,利用Tat 蛋白的穿膜活性将gag/pol 蛋白导入其它活细胞内,从而提高DNA 疫苗免疫水平。还有研究表明Tat49-57 短肽T9（RKKRRQRRR）有较强的穿膜功能,因此我们将这T9 与gag/pol融合表达,研究T9 的插入对DNA 疫苗的免疫水平的影响。本论文的主要工作是构建DNA 疫苗,将tat、T9 与HIV-1gag/pol 融合表达,检测DNA 疫苗的抗原性和免疫原性,研究Tat、T9 蛋白对提高HIV-1 DNA 疫苗免疫水平的作用。实验结果证明tat和gag/pol 融合表达能提高DNA 疫苗的细胞免疫水平。Tat 基因的插入提高HIV-1 DNA 疫苗的有效性,也为tat 应用于其他疫苗中提供了广阔实际应用前景。实验中我们发现T9 与gag/pol 的融合表达并不是象我们预期设想那样能提高HIV-1 DNA 疫苗的免疫水平,反而有所降低,我们将在以后的实验中进一步分析研究其原因。

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 HIV 病毒简介
• 1.1.1 HIV 的分型与分布
• 1.1.2 HIV-1 的分子生物学
• 1.1.3 HIV-1 的生活周期和致病机制
• 1.2 DNA 疫苗简介
• 1.2.1 DNA 疫苗免疫方式
• 1.2.2 DNA 疫苗引起CD8+细胞介导的 CTL 反应
• 1.2.3 Tat 蛋白的内化作用在DNA 疫苗中应用
• 1.3 本论文设计的构思
• 1.3.1 实验思路
• 1.3.2 实验程序
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 材料、仪器和试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 常用试剂配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒的小量提取
• 2.2.2 大肠杆菌E.coli 化学感受态的制备
• 2.2.3 大肠杆菌E.coli 电转感受态的制备
• 2.2.4 连接产物转化E.coli 电转感受态细胞
• 2.2.5 PCR
• 2.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.7 Western Blot
• 2.2.8 原核蛋白表达和纯化
• 2.2.9 利用LIPOFECTAMINE 2000 进行转染
• 2.2.10 CTL 操作规程
• 2.2.11 ELISPOT 操作规程
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 DNA 疫苗的构建及鉴定
• 3.1.1 VR1012-tat 质粒的构建及鉴定
• 3.1.2 VR1012-tat-gag/pol 质粒的构建及鉴定
• 3.1.3 VR1012-T9-gag/pol 质粒的构建及鉴定
• 3.2 Tat 抗体的制备
• 3.2.1 PrsetB-tat 质粒的构建及鉴定
• 3.2.2 Tat 蛋白表达和纯化
• 3.2.3 Tat 抗体的获得
• 3.3 DNA 疫苗的抗原性研究
• 3.4 DNA 疫苗的免疫原性研究
• 3.4.1 从体液免疫水平分析DNA 疫苗的免疫原性
• 3.4.2 从细胞免疫水平分析DNA 疫苗的免疫原性
• 3.5 通过 CTL.ELISPOT 检测Tat 的免疫原性
• 小结
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 原创性声明
• 导师简介
• 作者简介