高产纤维素酶菌的筛选鉴定及其液体发酵条件的研究

论文摘要

纤维素是地球上最丰富、来源最广泛的有机物质,是一类重要的可再生资源和能源。由于纤维素分子结构的特殊性,以及纤维素物质在自然界中存在状态的特殊性,使这类宝贵资源很难被合理利用。大量研究表明,生物降解法利用纤维素具有其它方法无法比拟的优点。要使纤维素被分解转化成小分子化合物或其它营养物质,筛选分离出能够快速降解转化纤维素的优良菌是关键。以常年堆积纤维素废弃物的场所、森林里腐烂的树木以及造纸废液死水下的污泥等作为优良菌源地,采集样品。通过纤维素刚果红培养基平板培养染色之后透明水解圈的大小和菌落直径大小的比值、滤纸纤维素培养基培养过程中滤纸崩溃速度和滤纸失重率的初筛,纤维素酶活测定的复筛,筛选分离到一株高纤维素酶活力的霉菌——ZN-205,结合菌株形态特性观察和18s rRNA基因序列分析,确定该菌株为爪哇正青霉（Eupenicillium javanicum）。研究了纤维素液体发酵时的培养条件和发酵培养基的成分对爪哇正青霉(Eupenicillium javanicumZN-205产酶的影响。在本论文实验研究条件下,实验得出：培养基最佳碳源为稻草粉,最佳氮源为KNO3,发酵体系中外加一定比例的麸皮能明显提高酶活力,而添加浓度合适的表面活性剂对产酶能力的提高没有显著作用。正交优化试验结果表明,在250mL三角瓶中装发酵液100mL,培养基起始pH为5.5,KNO3添加浓度为1.0%,稻草粉与麸皮比例为7：3,吐温添加量为0.4%,在温度为30℃,摇床转速为175r/min的条件下培养5d时菌株具有最大产酶能力,其中羧甲基纤维素（CMC）酶活为24.52IU/mL,滤纸酶活（FPA）为2.68IU/mL。对爪哇正青霉(Eupenicillium javanicunZN-205产生的胞外酶的提取方法、酶促反应条件进行了研究。结果表明：用3000r/min.15min的离心条件获得粗酶液,CMC酶活最高,其酶促反应最适温度为60℃、最适pH值为5.0；用4000r/min.10min离心条件获得粗酶液,FPA最高,其酶促反应最适温度为50℃、最适pH值为5.0。同时,对CMC酶和滤纸酶的稳定性进行了研究,CMC酶在pH 4-5之间酶的稳定性较好,在pH小于3和大于6时酶的稳定性都急剧下降；在40℃、50℃和60℃时酶热稳定性较好,而高于60℃时酶的稳定性急剧下降。滤纸酶在pH 5-6之间酶的稳定性比较好,而当pH大于7和小于4时酶活急剧下降；在40℃、50℃时热稳定性较好,而在60℃,70℃处理时酶活急剧下降,酶的稳定性较差。浓度为1.0mmol/L的Na+,K+, Fe2+,Mg2+对CMC酶活性和滤纸酶活有激活作用,而Zn2+,Cu2+,Ca2+,Mn2+对CMC酶活性和滤纸酶活性有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪言
• 1.1 前言
• 1.2 纤维素资源的组成
• 1.3 纤维素的生物降解
• 1.4 纤维素酶的组成及作用机理
• 1.4.1 分解纤维素的酶的分类
• 1.4.2 纤维素酶的作用机制
• 1.5 纤维素酶的应用
• 1.5.1 在畜牧中的应用
• 1.5.2 在食品工业及发酵酿造中的应用
• 1.5.3 其它方面的应用
• 1.6 纤维素菌种筛选培养基的探究
• 1.7 纤维素酶菌种选育情况
• 1.7.1 产纤维素酶菌的自然筛选
• 1.7.2 常规理化手段诱变育种
• 1.7.3 基因工程育种
• 1.8 本论文的研究内容和意义
• 1.9 本研究的主要内容和技术路线
• 第2章 高产纤维素酶菌的筛选
• 2.1 菌源
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 培养基
• 2.2.2.1 筛选培养基
• 2.2.2.2 保藏培养基
• 2.2.2.3 产酶培养基
• 2.2.3 实验试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 纤维素降解菌的初筛实验
• 2.3.2 纤维素降解菌的复筛实验
• 2.3.2.1 葡萄糖标准液的配制
• 2.3.2.2 酶活测定方法
• 2.3.2.3 酶活定义方法
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 初筛结果
• 2.4.1.1 从菌源初筛出的菌种
• 2.4.1.2 刚果红纤维素培养基筛选结果
• 2.4.1.3 滤纸纤维素观察培养基筛选结果
• 2.4.2 复筛结果
• 2.4.2.1 葡萄糖标准曲线制作
• 2.4.2.2 酶活复筛结果
• 2.5 讨论
• 2.5.1 纤维素分解菌的分离筛选方法
• 2.5.2 纤维素酶活力的测定方法
• 2.6 本章小结
• 第3章 高产纤维素酶菌的种属鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 工具酶及主要试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.4.1 LB液体培养基
• 3.1.4.2 LB固体培养基
• 3.1.5 试剂及溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 形态鉴定
• 3.2.2 18S rRNA基因分析
• 3.2.2.1 总DNA提取
• 3.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA
• 3.2.2.3 18s rDNA扩增
• 3.2.2.4 扩增产物的纯化
• 3.2.2.5 重组质粒的构建
• 3.2.2.6 大肠杆菌感受态制备
• 3.2.2.7 重组质粒的转化
• 3.2.2.8 重组质粒的鉴定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 形态鉴定
• 3.3.2 分子鉴定
• 3.3.2.1 总DNA的提取
• 3.3.2.2 18s rDNA全序列的扩增
• 3.3.2.3 重组质粒的提取
• 3.3.2.4 18s rDNA重组质粒的PCR鉴定电泳检测
• 3.3.2.5 18s rDNA序列分析
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 纤维素酶液态发酵条件的优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 爪哇正青霉ZN-205产酶影响因素实验
• 4.2.1.1 碳源对产酶的影响
• 4.2.1.2 麸皮添加对产酶的影响
• 4.2.1.3 不同氮源对产酶的影响
• 4.2.1.4 培养基起始PH值对产酶的影响
• 4.2.1.5 通气量对产酶的影响
• 4.2.1.6 摇床转速对产酶的影响
• 4.2.1.7 接种量对产酶的影响
• 4.2.1.8 培养时间和温度对产酶的影响
• 4.2.1.9 表面活性剂的添加对产酶的影响
• 4.2.2 正交优化实验
• 4.2.3 粗酶的提取
• 4.2.4 酶活的测定和定义方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 不同的碳源对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.2 稻草粉与麦麸比对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.3 不同氮源对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.4 起始pH对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.5 通气量对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.6 摇床转速对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.7 接种量对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.8 培养温度及时间对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.9 表面活性剂添加量对爪哇正青霉ZN-205产酶的影响
• 4.3.10 爪哇正青霉ZN-205产酶条件的正交优化
• 4.3.11 发酵工艺优化前后产酶比较
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 酶液的提取及粗酶性质的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 实验试剂
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 粗酶液制备
• 5.2.2 酶活测定方法
• 5.2.3 酶活计算及定义
• 5.2.4 粗酶液的提取
• 5.2.5 爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶酶促反应影响因素试验
• 5.2.5.1 底物大小对爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶酶促反应的影响
• 5.2.5.2 pH对爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶酶促反应的影响
• 5.2.5.3 温度对爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶酶促反应的影响
• 5.2.6 爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶稳定性性研究
• 5.2.6.1 纤维素粗酶的热稳定性
• 5.2.6.2 纤维素粗酶的pH稳定性
• 5.2.7 金属离子对纤维素粗酶酶活的影响
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 不同离心时间和离心转速提取粗酶对酶活的影响
• 5.3.2 爪哇正青霉ZN-205酶促反应条件研究
• 5.3.2.1 底物大小对爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶酶促反应的影响
• 5.3.2.2 PH对爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶酶促反应的影响
• 5.3.3.3 温度对爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶酶促反应的影响
• 5.3.3 爪哇正青霉ZN-205纤维素粗酶稳定性研究
• 5.3.3.1 纤维素粗酶的热稳定性
• 5.3.3.2 纤维素粗酶的pH稳定性
• 5.3.4 不同的金属离子对纤维素粗酶酶活的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 本论文的主要创新点
• 6.3 建议
• 参考文献
• 附录A:缩略词表
• 附录B:攻读硕士研究生期间的科研成果
• 致谢