论文摘要
成牙本质细胞的终末分化、牙本质矿化是一个复杂的过程,该过程由许多分子组成的信号网络共同调控,但目前具体的调控机制尚未完全明确。丝氨酸蛋白酶HtrA1（high-temperature requirement protein A1）与骨矿化进程密切相关。HtrA1促进风湿性关节炎、椎间盘退行性病变等溶骨性疾病的发生,同时在骨生理性矿化过程中起促进或抑制作用。骨形成发生蛋白2（bonemorphogenetic protein-2, BMP-2）为转化生长因子-p（transforming growth proteins-β, TGF-β）家族成员之一,能促进成牙本质细胞的终末分化及牙本质矿化,而基质谷氨酸蛋白（matrix Gla protein, MGP）则在牙本质形成及矿化中起抑制作用。HtrA1能拮抗TGF-β家族成员的表达及信号传递,裂解MGP。目前HtrA1是否参与牙本质的形成尚未明确,我们推测HtrA1可能通过调控BMP-2、 MGP的表达来调节牙本质的形成进程。本课题通过体内体外两部分实验来探讨HtrA1在成牙本质细胞的终末分化及牙本质矿化过程中的作用。第一部分HtrA1在牙发育过程、牙髓-牙本质复合体及修复性牙本质形成过程中的表达研究实验一HtrA1在小鼠牙发育过程中的免疫组化研究目的：观察HtrA1在牙发育过程中的表达分布,初步探讨其在牙发育过程中的作用。方法：制备昆明小鼠磨牙发育各期标本的石蜡切片,免疫组化技术检测HtrA1蛋白在小鼠第一磨牙发育过程中的表达分布。结果：胚胎13.5至16.5天,HtrA1表达在新生牙槽骨基质中；胚胎18.5天,HtrA1在牙槽骨、牙本质基质及牙囊组织中呈阳性表达；HtrA1表达于新生小鼠未矿化的牙槽骨基质、牙本质基质、牙囊及成釉器颈环处细胞；在出生后第5天,HtrA1在未矿化的牙槽骨基质、牙本质基质、牙囊、上皮根鞘及上皮根鞘邻近的牙乳头细胞中呈阳性表达；HtrA1阳性表达在2周龄小鼠的牙周膜、牙囊及未矿化的牙槽骨、前期牙本质中,而在完全矿化的牙槽骨、牙本质组织中不表达；HtrA1阳性表达于3月龄鼠的牙周膜、牙髓细胞及前期牙本质组织中。结论：HtrA1蛋白在小鼠磨牙发育过程具有时空表达特异性,推钡HtrA1可能在小鼠牙周组织及牙本质的形成过程中起作用。实验二HtrA1、BMP-2、MGP在人牙髓-牙本质复合体的表达研究目的：观察HtrA1、BMP-2、MGP在人正常牙冠组织切片中的表达分布,初步探讨三者在牙本质形成过程中的关系及作用。方法：收集临床拔除的健康成年人牙标本,免疫组化技术检测HtrA1、BMP-2及MGP蛋白在牙髓-牙本质复合体中的表达情况。结果：HtrA1、BMP-2、MGP都阳性表达在人牙髓-牙本质复合体的成牙本质细胞中,而不表达在髓腔内的其它细胞。结论：HtrA1、BMP-2及MGP蛋白都表达在人成牙本质细胞中,可能在成牙本质细胞的终末分化及牙本质矿化过程中相互作用。实验三：HtrA1与MGP在大鼠修复性牙本质形成过程中的表达研究目的：观察HtrA1与MGP在修复性牙本质形成过程中的表达与分布,初步探讨二者在该过程中的相互关系及作用。方法：选取20只大鼠行直接盖髓术,分别在0天、7天、14天及21天处死大鼠,分离上颌骨,制备组织切片,HE染色观察牙髓腔内组织学变化,并用免疫组织化学和量子点为基础的免疫荧光双染技术及CRi’s Nuance图象采集系统分析检测HtrA1及MGP蛋白在修复性牙本质形成过程中的表达变化。结果：修复性牙本质形成的量于术后第7天显著增加并持续增长至第21天；HtrA1MGP、nestin及BSP阳性表达于成牙本质细胞、成牙本质样细胞及未完全矿化的牙本质基质中；光谱分析结果表明,HtrA1、MGP的表达在术后第7天显著升高,而在第7天、14天及21天的表达无显著差异,HtrA1、MGP的表达分别与修复性牙本质的平方测量值呈正相关,但是HtrA1与MGP的表达无明显相关性。结论：HtrA1与MGP都参与修复性牙本质的形成过程；二者可能相互作用以调节修复性牙本质的形成。第二部分HtrA1在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用研究实验四HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的表达研究目的：检测HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的表达变化,初步探讨HtrA1、BMP-2及MGP在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的关系与作用。方法：诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化,检测分化过程中矿化结节的形成情况、碱性磷酸酶的活性情况及矿化相关指标ALP、I型胶原及DSP的表达情况,同时检测HtrA1、MGP及BMP-2的表达变化情况。结果：在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中,矿化结节形成的量、碱性磷酸酶的活性及矿化相关因子ALP、I型胶原及DSP的表达显著上调；HtrA1、 BMP-2及MGP的mRNA及蛋白的表达都呈逐渐升高趋势。结论：HtrA1、MGP及BMP-2共同参与人牙髓细胞成牙本质细胞样细胞的分化过程；三者可能在调控牙本质形成过程中相互作用。实验五HtrAl基因抑制后对牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化的影响目的：检测HtrA1基因抑制后矿化结节形成情况和矿化相关基因的表达,同时检测HtrA1、BMP-2及MGP的表达变化,探讨HtrA1在牙本质形成过程中的作用及作用机制。方法：构建两个人HtrA1基因shRNA慢病毒载体,包装病毒后感染人牙髓细胞。矿化诱导感染的牙髓细胞28天,检测HtrA1基因抑制后对矿化结节形成、碱性磷酸酶活性的表达及矿化相关基因的表达的影响,同时检测HtrA1、MGP及BMP-2的表达变化情况。结果：在矿化诱导过程中,与阴性对照组相比,HtrA1基因抑制后显著减少矿化结节的形成,降低碱性磷酸酶的活性,下调矿化相关因子ALP、I型胶原及成牙本质细胞分化标记物DSP的表达。同时,HtrA1基因抑制后下调BMP-2mRNA的表达,上调MGP mRNA及蛋白的表达。结论：HtrA1可以促进人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化及牙本质矿化,它可能通过调控BMP-2及MGP的表达来调节牙本质的形成过程。