多壁纳米碳圈对人血管内皮细胞的DNA损伤及其机制研究

论文摘要

【目的】随着纳米技术的迅速发展及纳米材料的大量增多，纳米技术的安全性问题正引起世界范围的重点关注。多壁纳米碳圈（MWCNO）是富勒烯（C60）的同素异形体，又称为嵌套的富勒烯（nested fullerenes）。本实验使用的MWCNO是由电弧法制备的直径在30nm左右纳米材料。有研究表明碳纳米颗粒进入肺部后能转移到心血管系统，同时有人试图将其用作抗肿瘤等药物的载体，进入血液后可直接接触并作用于心血管系统，因此其安全性研究显得特别重要。Frank Chen等已就MWCNO对人皮肤成纤维细胞的细胞毒性和基因组学水平的影响进行研究，结果表明MWCNO可引起一系列与细胞代谢、凋亡、细胞周期、应激反应、细胞信号转导和炎症反应相关基因的mRNA水平的改变。但至今未见MWCNO对心血管系统影响的研究报道。磷酸化的组蛋白H2AX（γH2AX）是目前国内外研究细胞DNA损伤的热点之一，γH2AX在DNA损伤的修复以及DNA损伤位点检查点蛋白的聚集中发挥着重要的作用，特别是DNA双链的损伤。许多与染色体结构的维持、保护、修复相关的蛋白质有组织按顺序地在DNA损伤位点结合形成焦点（foci）复合物，共同完成对DNA损伤的检测和修复，并且在此过程中根据损伤程度的不同导致细胞周期停顿或细胞凋亡。因此，根据细胞在受到DNA损伤尤其是DNA双链断裂损伤后，在DSBs位点会出现由γH2AX形成的焦点这一特性，γH2AX已成为检测细胞DNA损伤的一个新的特异性指标。体内外研究发现多种纳米颗粒可以引起机体产生ROS。目前许多空气颗粒物(主要为PM2.5、PM10)和超微颗粒（UFPs）造成DNA损伤的研究都集中在氧化应激诱导的机制，认为DNA是ROS的主要靶点，ROS的产生是空气中颗粒物质引起DNA损伤的重要机制。本研究观察MWCNO是否引起血管内皮细胞凋亡、细胞周期改变、DNA损伤及其损伤机制，以评价MWCNO潜在的心血管毒性。【方法】采用体外实验的方法。用台盼蓝染色法观察不同浓度（0.2、1、5、25、50、100、200μg／ml）的MWCNO对人血管内皮细胞（HUVEC）的抑制率，根据确定的半数抑制浓度(IC50)设定本实验的剂量。用检测细胞周期、凋亡的试剂盒检测不同浓度（0.2、1、5μg／ml）的MWCNO染尘后血管内皮细胞的细胞周期和凋亡的变化情况。用免疫荧光法观察不同剂量（同上）的MWCNO染尘后血管内皮细胞中磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）焦点形成情况，比较细胞核内焦点形成的数量及荧光强度。用DCFH-DA法检测不同剂量（同上）的MWCNO染尘后血管内皮细胞内ROS水平的变化情况。免疫荧光显微镜图片用Image Pro Plus软件进行γH2AX焦点定量计数。所有结果采用SPSS统计软件分析。【结果】流式细胞仪凋亡检测显示：1、5μg／ml的MWCNO显著促进了HUVECs细胞的凋亡，凋亡率与对照组比较有显著性差异。细胞周期检测显示，各浓度MWCNO作用后均未引起明显的细胞周期改变，G1、G2、S期细胞比例与对照组比较均无显著性差异。γH2AX识别抗体免疫荧光技术检测了MWCNO对HUVECs细胞DNA双链损伤的情况，结果发现MWCNO能诱导γH2AX焦点形成，并具有剂量和时间依赖性，高浓度（5μg／ml）MWCNO诱导的γH2AX焦点数目最多，荧光强度也最强，随着时间延长γH2AX焦点的数量及强度也随之增多、增强。各浓度MWCNO处理的HUVECs细胞12h后可引起细胞内ROS水平升高，各处理组与对照组的差异有统计学意义，处理24h后ROS有所下降，但与对照组比较仍有上升趋势，其中5μg／ml与对照组比较p=0.052。【结论】MWCNO（1-5μg／ml）能引起HUVEC细胞DNA断裂和细胞凋亡，并伴有ROS水平升高，提示其损伤机制可能与MWCNO诱导ROS增加，引起氧化损伤有关。

论文目录

• 缩略语
• 多壁纳米碳圈对人血管内皮细胞DNA损伤及其机制研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 1 纳米/超微颗粒转运到心血管系统
• 2 纳米/超微颗粒对心血管的毒作用
• 3 纳米颗粒对心血管作用的可能机制
• 4 展望
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 致谢