论文摘要
农作物种子的发育都要经过干燥脱水这个阶段走向成熟,而干燥脱水又是农作物种子从休眠走向萌发的桥梁。种子胚和胚乳在干燥脱水过程中,特定蛋白质存在着差异变化,对胚和胚乳干燥后熟过程发挥着重要影响。对在干燥后熟过程胚和胚乳中蛋白质组变化的研究有助于我们更进一步认识玉米种子的干燥脱水过程。脱落酸响应蛋白（Responsive to ABA, RAB） RAB17属于脱水素家族（DHNs）,也属于胚胎发育晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant protein, LEA）第二家族LEAⅡ,它在成熟脱水后的种子中大量存在,在萌发后降解,对种子脱水耐性的形成和干燥后熟过程发挥着重要的作用,影响着种子的萌发。研究表明,RAB17在细胞内存在着多种生理功能,在干旱,低温,盐碱等多种逆境胁迫下均有表达,它在细胞内还能稳定大分子及其细胞结构。对RAB17的研究很多,在细胞内RAB17的功能受到细胞内激酶CK2的调节。Marta Riera等（2004）通过对玉米胚中提取物的体外磷酸化分析发现,RAB17蛋白的磷酸化可能由CK2蛋白激酶以外的一种蛋白激酶参与其磷酸化。在逆境胁迫条件下,Goday等（1994）研究发现,番茄RAB17同源蛋白TAS14在体外由CK2和一个cAMP依赖型蛋白激酶磷酸化,但是,没有进一步的报道。脱落酸响应蛋白RAB17在玉米自交系08-641全种子脱水干燥前后有差异表达。对玉米自交系S37穗自然干燥处理,利用双向电泳技术分析了其自然干燥前后胚和胚乳蛋白质组的变化,并在胚中同样检测到存在着上调表达的蛋白RAB17。根据NCBI数据库查询结果,采用巢式PCR的方法从玉米自交系08-641种子胚中克隆rab17基因,构建RAB17原核表达载体,转入大肠杆菌表达原核表达蛋白,并对原核表达蛋白纯化制备螯合层析柱,从具有活性的玉米胚全蛋白中Pull-down筛选互作蛋白,通过双向电泳质谱分析鉴定互作蛋白。利用生物信息学方法,完成了rab17核酸和编码蛋白的特征分析、进化关系,还对筛选到互作蛋白LOC100276911进行了分子量、等电点、结构以及相应进化关系等分析,利用分析结果,克隆了该互作蛋白的基因、并进行了原核表达,用于后期更进一步的研究。主要研究结果如下：（1）利用双向电泳技术和质谱技术,共计鉴定出自交系S37穗自然干燥前后胚中差异表达蛋白30个和胚乳中差异表达蛋白16个,其中在胚中检测到与自交系08-641干燥后熟后同样上调表达的蛋白RAB17,但两者存在不一致,即RAB17蛋白存在表达多态性。（2）依据对自交系08-641全种子干燥后熟过程差异表达蛋白RAB17分析结果,从其成熟胚中克隆得到了长度为507bp的rab17 CDS区。生物信息学表明,其具有等位基因差异性和表达多态性。（3）通过构建rab77的原核表达载体,成功表达带6xHis的原核表达蛋白和提取玉米胚活性蛋白,pull-down筛选到了RAB17蛋白的互作蛋白,通过双向电泳和质谱鉴定该蛋白为LOC100276911。（4）生物信息学分析表明,互作蛋白在禾本科植物中具有一定的保守性。从玉米胚中克隆了其表达基因的CDS区,构建原核表达载体,成功得到了原核表达蛋白。综上,我们成功从自交系S37中鉴定到了干燥后熟差异表达蛋白RAB17,从自交系08-641成熟玉米胚中克隆了rab17,得到了其互作蛋白LOC100276911,阐述了RAB17蛋白在玉米自交系中具有表达多态性,其在玉米脱水后熟过程中发挥着关键作用,为进一步进行互作蛋白酵母双杂交验证和RAB17蛋白的功能分析奠定了基础。