肺癌相关新基因的克隆与筛选及新的候选原癌基因OLC1的功能研究

论文摘要

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，在中国，肺癌的发病率逐年上升，现已居恶性肿瘤发病率的首位。在过去的十余年中，我们已经对肺癌的分子遗传学改变有了一定的认识，然而，肺癌发生的确切机制仍然不清楚。 在本研究中，我们克隆了51个肺癌相关新基因，并对其进行了功能和表型筛选。通过筛选，我们发现一个基因OLC1（overexpressed in lung cancer），能在报告基因水平激活NF-kappaB通路，外源高表达能使NIH／3T3细胞形成明显的转化集落。本研究将OLC1稳定转染NIH／3T3细胞，通过体内外实验评估其恶性转化功能。用特异性针对OLC1的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默OLC1的表达，并以此评价OLC1在肿瘤细胞增殖生长中的作用。为了在蛋白水平检测OLC1的表达，我们生产，纯化，并鉴定了OLC1的多克隆抗体，用免疫组织化学染色结合组织微阵列技术检测OLC1蛋白在肺癌和正常组织中的表达水平。本研究还用凝胶阻滞等方法检测OLC1对NF-kappaB通路的激活作用。 我们的研究结果显示，OLC1的稳定高表达能显著加快NIH／3T3细胞的生长速度，使其失去接触抑制，获得在软琼脂中锚定非依赖性生长的能力；体内实验表明，高表达OLC1的NIH／3T3细胞能在裸鼠身上形成纤维肉瘤，而未转染细胞和空载体转染细胞则不能形成；用特异性siRNA沉默OLC1在肺癌细胞系H520和H1299中的表达能引起生长抑制，并能在不需要其它附加凋亡诱导物的情况下引起细胞凋亡；免疫组织化学染色显示，OLC1的高表达能在大多数肺癌类型中检测到，特别是在肺癌发生的早期，如不典型增生和原位癌的阶段；我们的结果还证明OLC1能在肿瘤细胞中激活NF-kappaB通路。 综上所述，我们的研究结果提供了充分的证据，证明OLC1在肺癌的发生中扮演着重要的角色，具有原癌基因的属性，同时也提示OLC1用于肺癌早期诊断和治疗靶标的可能性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 人肺癌相关新基因的克隆与筛选
• 一、候选基因的来源及生物信息学初步分析
• 二、候选基因全长开放阅读框架的克隆及真核表达载体的构建
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 三、人肺癌相关新基因的功能及表型筛选
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 四、第一部分讨论
• 五、第一部分小结
• 第二部分 人肺癌相关新基因OLC1的生物信息学分析
• 一、由EST到OLC1全长cDNA
• 二、OLC1开放阅读框架分析
• 三、OLC1蛋白结构域和序列同源性分析及进化树的建立
• 四、OLC1染色体定位及基因结构分析
• 五、电子表达谱分析
• 六、OLC1启动子预测
• 七、第二部分讨论
• 八、第二部分小结
• 第三部分 OLC1在肺癌组织及相关细胞系中的表达情况
• 一、OLC1的原核表达及纯化
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 二、多克隆抗体的制备、纯化与鉴定
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 三、OLC1的细胞定位
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 四、OLC1在永生化支气管上皮细胞系和肺癌细胞系中的表达情况
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 五、OLC1在肺癌组织及正常对照组织中的表达情况
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 2.1.组织切片的免疫组织化学染色结果
• 2.2.组织微阵列的免疫组织化学染色结果
• 六、第三部分讨论
• 七、第三部分小结
• 第四部分 OLC1作为候选原癌基因的功能研究
• 一、稳定过表达OLC1的NIH／3T3细胞株的筛选与鉴定
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 二、OLC1的异源过表达使NIH／3T3细胞生长速度加快
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 三、OLC1的异源过表达使NIH／3T3细胞在软琼脂中形成集落
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 四、OLC1的异源过表达使NIH／3T3细胞在裸鼠皮下形成肿瘤
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 五、第四部分讨论
• 六、第四部分小结
• 第五部分 RNA干扰沉默OLC1的表达
• 一、siRNA目标位点的设计及siRNA的化学合成
• 二、siRNA沉默效果的鉴定
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 三、沉默OLC1的表达,引起肺癌细胞系的凋亡
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 2.1.显微镜下观察细胞凋亡
• 2.2.流式细胞仪分析
• 2.3.western blot分析
• 四、沉默OLC1的表达,引起肺癌细胞系生长变缓
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 五、沉默OLC1的表达,引起肺癌细胞系集落形成减少
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 六、第五部分讨论
• 七、第五部分小结
• 第六部分 OLC1能激活NF-kappaB信号转导途径
• 一、瞬时表达的OLC1能激活pNF-κB-luc报告基因
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 二、OLC1能促进NF-kappaB向细胞核移位
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 三、OLC1对NF-kappaB通路激酶的磷酸化调节作用
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 四、OLC1系列缺失体的构建及其对pNF-κB-luc报告基因的激活作用
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 五、第六部分讨论
• 六、第六部分小结
• 总结
• 参考文献
• 文献综述
• 附录
• 一、主要仪器设备及耗材
• 二、常用溶液配制
• 三、统计学分析方法
• 四、英文缩略词表
• 五、论文中用到的载体图
• 致谢
• 本研究受下列基金资助
• 学位论文原创性声明
• 版权声明