论文题目: 宣威火腿加工过程中肌内脂肪水解及磷脂水解酶的纯化鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 农产品加工与贮藏工程
作者: 杨红菊
导师: 马长伟
关键词: 宣威火腿,肌内脂肪,脂肪水解,磷脂水解酶,纯化
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 宣威火腿是中国典型的传统干腌肉制品,其最突出的质量特点就是具有独特而浓郁的腌腊风味。国外同类产品的研究表明,脂肪在干腌火腿风味形成中起重要作用,它们既是形成风味物质的前体,也是风味化合物蓄积的溶剂。关于宣威火腿的肌内脂肪变化至今未见相关研究报道。本实验旨在研究宣威火腿加工过程中肌内脂肪的水解规律,并对引起此变化的相关酶类进行纯化、鉴定及性质研究,以期对其风味形成机理提供依据,并为宣威火腿品质改良和工业化生产奠定理论基础。 宣威火腿加工过程中各脂肪组分的水解结果表明:1) 宣威火腿原料腿股二头肌的脂肪含量约为2.9%。其中中性脂肪、磷脂和游离脂肪酸所占的比例分别为73.2%,25.3%,2.3%。中性脂肪中油酸所占比例最大,而磷脂中含量最大的脂肪酸为亚油酸。2) 在宣威火腿加工过程中,中性脂肪无显著性变化,而约77%的磷脂发生了降解,说明磷脂是干腌火腿加工过程中肌内脂肪水解的主要底物。3) 磷脂的水解并不是按脂肪酸的构成比例均匀地水解,而是存在着一定的选择性,多不饱和脂肪酸水解程度最大,减少87.7%;其次是饱和脂肪酸,减少76.9%;单不饱和脂肪酸仅减少56.3%,其中亚油酸、棕榈酸和花生四烯酸水解程度最高。 本研究初步建立了一个新的磷脂水解酶活性测定方法。新方法的原理为通过微量测磷法检测磷脂的减少来反应磷脂水解酶活性的大小。新方法的条件确定为采用0.9ml酶液,加50μ15mM的大豆卵磷脂为底物,40℃反应20分钟,加入2ml氯仿-甲醇混合液（2:1,v:v）终止反应并加入0.2ml KC1（2mol/L）/EDTA（0.5mmol/L）混合液提高回收率。该方法的最小检出限为2.68nmol磷脂,变异系数为3.24%,回收率为89%,且和同位素法存在良好的线性关系,可以辅助同位素法进行磷脂水解酶的纯化工作。 本文首次从猪骨骼肌中获得了两种电泳纯的磷脂水解酶,表观分子量分别约为66kDa和37kDa。66kDa磷脂水解酶具有一定的4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性,比活为32nmol/h/mg蛋白质,而37kDa磷脂水解酶不具有这种荧光底物活性。气相色谱法鉴定这两种磷脂水解酶都同时具有A1和A2活性,且A1活性更高。肽质量指纹图谱分析表明,66kDa磷脂水解酶和其它组织来源的磷脂酶或脂酶都不具有序列上的同源性。66kDa磷脂水解酶的最适温度为40℃,最适pn为8.5,其活性的发挥不需要Ca2+,脂酶抑制剂NaF对酶活具有抑制作用,DTT、ATP及Fe2+、Fe3+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等金属离子对酶活具有激活作用。腌制剂中,NaCl对66kDa磷脂水解酶活性有抑制作用,100ppm以上的硝酸钠有激活作用,30～150ppm的亚硝酸盐对66kDa磷脂水解酶活性没有影响。
论文目录:
第一章 前言
1．1 立题意义及研究目的
1．1．1 传统宣威火腿的由来及制作工艺
1．1．2 宣威火腿传统工艺中存在的问题
1．1．3 立题依据
1．2 国内外研究现状
1．2．1 脂肪的组成
1．2．2 脂类物质在干腌火腿加工过程中的变化
1．2．3 脂类物质在干腌火腿风味形成中的作用
1．3 本研究内容和实验方案
第二章 宣威火腿加工过程中肌内脂肪的水解变化
2．1 前言
2．2 材料与方法
2．2．1 主要设备和试剂
2．2．2 样品来源及处理方法
2．2．3 脂肪的提取
2．2．4 各脂肪组份的分离
2．2．5 磷脂的定量
2．2．6 脂肪酸的测定方法
2．2．7 统计分析
2．3 结果与讨论
2．3．1 原料腿的肌内脂肪组成
2．3．2 肌内脂肪在加工过程中的水解变化
2．4 小结
第三章 磷脂水解酶测定方法的建立
3．1 前言
3．2 材料与方法
3．2．1 主要试剂
3．2．2 主要仪器设备
3．2．3 同位素标记底物检测方法
3．2．4 新方法-微量测磷法
3．2．5 统计分析
3．3 结果与讨论
3．3．1 反应条件的选择
3．3．2 测定方法的检验
3．3．3 两种方法的比较
3．4 小结
第四章 猪骨骼肌中磷脂水解酶的分离纯化
4．1 前言
4．2 材料与方法
4．2．1 动物性材料
4．2．2 试剂
4．2．3 主要仪器设备
4．2．4 磷脂水解酶的粗分离
4．2．5 磷脂水解酶活性测定方法
4．2．6 磷脂水解酶的纯化制备
4．3 结果与讨论
4．3．1 粗提缓冲液的缓冲溶剂种类、pH、缓冲容量的选择
4．3．2 盐析条件的优化
4．3．3 磷脂水解酶的纯化制备
4．4 小结
第五章 磷脂水解酶的性质研究
5．1 前言
5．2 材料与方法
5．2．1 实验材料
5．2．2 实验方法
5．3 结果与讨论
5．3．1 磷脂水解酶纯度和分子量的鉴定
5．3．2 磷脂水解酶的动力学测定
5．3．3 水解4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性
5．3．4 气相色谱法测定磷脂水解酶的A_1、A_2活性
5．3．5 磷脂水解酶同源性分析
5．3．6 温度对磷脂水解酶2活性的影响
5．3．7 pH对磷脂水解酶2活性的影响
5．3．8 激活剂、抑制剂对磷脂水解酶2活性的影响
5．3．9 金属离子对磷脂水解酶2活性的影响
5．3．10 腌制剂对磷脂水解酶活性的影响
5．4 小结
第六章 全文结论与展望
6．1 研究总结
6．2 论文的创新点
6．3 展望
参考文献
附录
致谢
作者简介
发布时间: 2005-07-18
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