Bacillus lentus CICIM304异淀粉酶的基因克隆、鉴定与表达

论文摘要

异淀粉酶（EC3.2.1.68）能够水解支链淀粉和糖原内部的α-1,6-糖苷键而形成直链淀粉，为淀粉彻底水解所必须，在生产和科研领域俱有应用价值。微生物和植物都能够产生异淀粉酶，其中微生物来源的异淀粉酶由于生产效率高，易于提取以及成本低廉而更具工业前景。相比于另一类型的淀粉脱枝酶普鲁兰酶，异淀粉酶能同时从内部和外部水解支链淀粉的分支点，其催化反应具有不可逆性且催化活性不会被麦芽糖所抑制。然而现有的少数几种异淀粉酶因为产量过低或在工业淀粉水解条件下不稳定，仍无法取代普鲁兰酶而广泛应用。为此，本论文首先改良了地衣芽孢杆菌表达系统，通过温敏型传递质粒的两轮同源重组构建了淀粉酶和部分蛋白酶失活的表达宿主；接下来采用蛋白质谱鉴定-反向PCR的策略实现了新型芽孢杆菌异淀粉酶编码基因的克隆；同时通过分子生物学手段完成了该异淀粉酶在大肠杆菌中的表达和重组酶的纯化及功能鉴定；然后根据半理性设计的原则，选取了高保守位点周围的区域进行氨基酸点突变，提高了突变株的催化性能。本研究获得主要结果如下：1.改良了地衣芽孢杆菌表达系统，通过温敏型传递质粒的两轮同源重组构建了淀粉酶和部分蛋白酶失活的表达宿主。分别从地衣芽孢杆菌基因组DNA中扩增出α-淀粉酶编码基因amyL和一种主要蛋白酶的编码基因aprE的部分结构基因，以此为基础构建了传递质粒pNZTATN和pNZTPTS。将它们转化入地衣芽孢杆菌后，经过传代培养，促使传递质粒与基因组DNA发生两轮同源重组，将基因组DNA上的amyL和aprE基因替换为无功能的人工片段，获得重组菌从而实现α-淀粉酶和蛋白酶编码基因的失活。重组菌分泌的淀粉酶活为原始菌的0.9%，蛋白酶为原始菌的35%。该方法可以成为芽孢杆菌表达宿主功能改造的有效工具。2.对细菌Bacillus lentus CICIM304异淀粉酶基因进行了克隆、鉴定和大肠杆菌中的功能性表达。Bacillus lentus CICIM304异淀粉酶的基因序列国内外尚无报道。将该异淀粉酶使用胰蛋白酶酶解后进行液质色谱串联质谱分析，从中鉴定得到192个肽段，其中3个肽段与细菌普鲁兰酶同源性较高。基于所获得肽段的氨基酸序列，设计简并引物扩增出异淀粉酶编码基因内部1400bp的核苷酸片段。然后使用反向PCR技术进行染色体步移，克隆出长度为2658bp的异淀粉酶编码基因iam1，其编码产物含886个氨基酸残基，与已报道的异淀粉酶的同源性低于40%。以质粒载体pET-28a （+）为基础构建相关表达载体，实现了异淀粉酶在大肠杆菌中的功能性表达，重组菌细胞破碎液上清中酶活为17.6±0.5U/mL。3.纯化重组异淀粉酶并对其酶学性质进行了研究。使用亲和层析获得了重组异淀粉酶纯品，SDS-PAGE中显示其分子量约为100kDa。酶学性质研究结果显示，其最适反应温度为70oC，在此温度下保温1h后仍能保留90%以上的酶活。最适反应pH为6.5，在pH6.0-8.5的范围内能够保持较高的催化活性。Ca2+、Mg2+、Mn2+、Na+、K+、Co2+对该酶具有激活作用；Zn2+、Sn2+、Fe3+对酶活抑制超过50%。该酶对EDTA，柠檬酸盐和PMSF的敏感性较低。2mol/L的脲和30mmol/L的SDS都会造成酶的显著失活。20%的麦芽糖和20mmol/L的α-环糊精对酶活无影响，50mmol/L的α-环糊精也仅抑制4%的酶活。4.根据半理性设计的原则，选取了高保守位点周围的区域进行氨基酸点突变，提高了异淀粉酶的催化性能。通过基因定点突变，确定了异淀粉酶的结构域I, III和IV中的Asp509, His514和Glu609为关键氨基酸，它们的改变会导致酶的完全失活；而His698的突变对酶活有轻微影响。接着选取了高保守位点周围的非保守区域进行突变，通过间接影响保守位点，而避免因为直接修改保守位点导致的酶的结构与功能的大幅改变导致的活力完全丧失。在对三个突变位点的总共九个替代中多个突变体的Km值都有所降低，其中突变体R505E和G608V的最大反应速率（Vmax）比野生型异淀粉酶分别提高了11%和25%，比酶活分别提升了13%和33%。5.使用双基因失活的地衣芽孢杆菌表达宿主，实现了异淀粉酶的高效表达。使用双功能启动子PQ和来源于地衣芽孢杆菌amyL基因的信号肽介导异淀粉酶在芽孢杆菌中分泌表达。摇瓶发酵条件下在枯草芽孢杆菌1A717中表达了74U/mL的异淀粉酶活。分别使用电转化和原生质体方法将表达质粒转化入解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。通过酶解支链淀粉以及制备特殊底物，验证了异淀粉酶在两种芽孢杆菌中实现功能表达。将重组质粒pHYQSIA转化入双基因失活的地衣芽孢杆菌APD1中，摇瓶条件下96h后产酶221U/mL。在15L发酵罐中进行放大实验，分批发酵条件下72h后酶活最高达到2140U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 概述
• 1.2 异淀粉酶的研究进展
• 1.2.1 异淀粉酶的结构与催化机理
• 1.2.2 异淀粉酶产生菌种
• 1.2.3 异淀粉酶的基因工程研究
• 1.3 异淀粉酶的应用
• 1.4 耐热淀粉酶
• 1.5 芽孢杆菌生产异淀粉酶
• 1.6 本课题的立题依据及研究内容
• 第二章 基因工程改造地衣芽孢杆菌表达宿主
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株，质粒和引物
• 2.2.2 工具酶和试剂
• 2.2.3 培养基与培养方法
• 2.2.4 大肠杆菌的转化
• 2.2.5 芽孢杆菌的转化
• 2.2.6 主要仪器
• 2.2.7 生物量测定
• 2.2.8 葡萄糖浓度测定
• 2.2.9 α-淀粉酶活测定
• 2.2.10 蛋白酶活测定
• 2.2.11 寡糖的高压液相色谱分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 传递质粒在地衣芽孢杆菌中温度敏感性测试
• 2.3.2 淀粉酶基因失活传递质粒的构建
• 2.3.3 地衣芽孢杆菌ATCC 14580 amyL基因的失活
• 2.3.4 重组地衣芽孢杆菌发酵及α-淀粉酶活检测
• 2.3.5 蛋白酶基因失活传递质粒的构建
• 2.3.6 地衣芽孢杆菌ATCC 14580 aprE基因的失活
• 2.3.7 重组地衣芽孢杆菌发酵及蛋白酶活检测
• 2.4 本章小结
• 第三章 异淀粉酶的质谱鉴定和编码基因的克隆
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 工具酶和试剂
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 细菌基因组DNA的提取
• 3.2.6 DNA含量的测定
• 3.2.7 PCR所用寡核苷酸引物和程序
• 3.2.8 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.9 核苷酸序列测定方法
• 3.2.10 SDS-PAGE
• 3.2.11 变性蛋白的胶内酶解
• 3.2.12 nanoLC-ESI-Q-TOF/MS/MS鉴定
• 3.2.13 质谱结果分析
• 3.2.14 基因克隆
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 CICIM304 菌株的鉴定
• 3.3.2 异淀粉酶纯酶的nanoLC-ESI-Q-TOF/MS/MS分析结果
• 3.3.3 B. lentus 异淀粉酶基因的克隆
• 3.4 本章小结
• 第四章 异淀粉酶基因的功能鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 工具酶和试剂
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 B. lentus基因组DNA的提取
• 4.2.6 寡核苷酸引物
• 4.2.7 SDS-PAGE
• 4.2.8 大肠杆菌表达载体的构建
• 4.2.9 异淀粉酶在大肠杆菌中的表达及粗酶液制备
• 4.2.10 酶活测定
• 4.2.11 重组异淀粉酶的纯化
• 4.2.12 重组异淀粉酶基本酶学性质
• 4.2.13 蛋白质浓度测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 B. lentus 异淀粉酶大肠杆菌表达载体的构建
• 4.3.2 iam1 的功能鉴定
• 4.3.3 iam1 及其推衍氨基酸比对分析
• 4.3.4 重组异淀粉酶的纯化
• 4.3.5 温度和pH对重组异淀粉酶的影响
• 4.3.6 化学物质对异淀粉酶的影响
• 4.3.7 重组异淀粉酶动力学常数的测定
• 4.3.8 重组异淀粉酶对不同底物的特异性
• 4.4 本章小结
• 第五章 半理性设计改造异淀粉酶
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株，质粒和引物
• 5.2.2 突变引物
• 5.2.3 工具酶和试剂
• 5.2.4 分子操作
• 5.2.5 培养基与培养条件
• 5.2.6 主要仪器
• 5.2.7 重组异淀粉酶的酶活测定
• 5.2.8 重组异淀粉酶的纯化
• 5.2.9 重组异淀粉酶酶学性质及反应动力学常数测定
• 5.3 结果
• 5.3.1 异淀粉酶关键氨基酸的确定
• 5.3.2 异淀粉酶基因的最小化处理
• 5.3.3 异淀粉酶基因关键氨基酸突变结果
• 5.3.4 异淀粉酶突变位点的选取
• 5.3.5 异淀粉酶突变体的获得
• 5.3.6 异淀粉酶突变体在大肠杆菌中的表达与纯化
• 5.3.7 异淀粉酶突变体酶活及动力学常数的测定
• 5.3.8 突变对酶热稳定性的影响
• 5.3.9 突变对酶pH稳定性的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 重组地衣芽孢杆菌高效表达异淀粉酶
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌株、质粒和引物
• 6.2.2 工具酶和试剂
• 6.2.3 培养基和培养条件
• 6.2.4 主要仪器
• 6.2.5 摇瓶发酵试验
• 6.2.6 异淀粉酶酶活测定
• 6.2.7 SDS-PAGE
• 6.2.8 寡糖的高压液相色谱分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 iam1 基因常用限制性酶切位点的消除
• 6.3.2 芽孢杆菌表达质粒的构建及异淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达
• 6.3.3 异淀粉酶在解淀粉芽孢杆菌中的表达及酶活鉴定
• 6.3.4 异淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的表达及酶活鉴定
• 6.3.5 重组异淀粉酶酶活的定量分析
• 6.3.6 异淀粉酶在双基因失活菌株中的表达
• 6.3.7 重组菌质粒遗传稳定性
• 6.3.8 15 L 发酵罐分批发酵产异淀粉酶
• 6.3.9 重组异淀粉酶与商品细菌普鲁兰酶脱枝作用比较
• 6.3.10 重组异淀粉酶应用评价
• 6.4 本章小结
• 结论
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文