精细定位控制抽穗期、株高和每穗颖花数的QTL与图位克隆汕优63中控制胶稠度、糊化温度的基因

论文摘要

抽穗期、株高和每穗颖花数都是水稻生长发育过程中重要农艺性状,在以前研究中我们在第7染色体着丝粒区段鉴定到一个同时影响抽穗期、株高和每穗颖花数的QTL。为了弄清这3个性状是由一个基因还是多个紧密连锁的基因控制和分离克隆该QTL,我们构建了一个以珍汕97为背景的近等基因系Hd1。在Hd1中包含4个来自供体亲本的片段,其中仅第7染色体上来自供体亲本的区段与3个目标性状相关。用Hd1与珍汕97杂交构建用于精细定位的F2大群体。F2群体单株的表型可分为2类:一类为具有早抽穗、株高较矮和每穗颖花数较少等特征,与珍汕97表型类似;另一类具有晚抽穗、株高较高和每穗颖花数较多等特征,与明恢63表型类似。它们之间比例为1:3（随机挑选190个单株统计结果,x2=0.11,P=0.740）。在具有8400个单株的F2群体中,挑选1080个极端早抽穗的单株用于精细定位。这些极端早抽穗的单株都具有株高矮和每穗颖花数少的特征。通过对标记与目标性状之间的重组单株分析,将控制目标性状的基因定位在标记RM3859和C39之间,与标记RM5436和RM5499共分离。标记RM3859和C39之间物理距离约为2.5 Mb,标记RM5436和RM5499之间物理距离为912.4 kb。由于目标基因位于着丝粒区段,发生重组抑制,所以无法通过扩大群体来进一步缩小目标区间。直链淀粉含量、胶稠度、糊化温度是评价水稻蒸煮食味品质的重要指标。本课题组以前的研究结果将控制这三个性状的基因定位在第6染色体短臂末端与Wx基因紧密连锁的区段。为了弄清这3个性状是由一个多效基因还是三个紧密连锁的基因控制,我们利用本课题组构建好的近等基因系珍汕97（Wxb）与珍汕97回交,得到5280个株系的F2大群体。从大群体中挑选1084株性状与明恢63一致的单株用于图位克隆。通过分子标记分析将目标基因定位在一个明恢63 BAC克隆35M22和对应的珍汕97 BAC克隆2N1上,利用鸟枪法对这两个BAC克隆进行测序。对目标基因与在两个亲本之间有多态性的亚克隆标记进行重组事件分析,将目标基因定位在标记C6与P80之间,并与标记Mx4和C4共分离。将C6和P80的序列与35M22的序列比较显示这两个标记间的物理距离是14 kb,把目标基因限定在14kb的片段上,对14 kb片段的序列进行分析,其中仅包含一个完整的基因Wx基因和一个不完整的反转录转座子。结果表明,这3个性状均由Wx基因控制。在以前的研究中对认为,Wx基因编码合成颗粒淀粉合成酶,控制直链淀粉合成,而糊化温度主要由编码可溶性淀粉合成酶的Alk基因控制。但很少有报道关于Wx基因对糊化温度和胶稠度的影响。为了分析Wx基因与糊化温度及胶稠度的关系,本研究中分析了97个不同地方品种的Wx基因和Alk基因的多样性及其它们与这3个性状的关系。结果发现Wx基因对糊化温度有约7%的贡献率,Alk基因则解释了糊化温度约91%的变异,Wx基因和Alk基因对胶稠度都有贡献,Wx基因对胶稠度的影响大于Alk基因的影响（Wx基因解释了胶稠度约53%的变异,而Alk基因解释了胶稠度约37%的变异）,而Alk基因与直链淀粉含量完全不相关。这两个基因可能都是通过改变胚乳淀粉组成来改变淀粉结构,从而影响淀粉理化性状。在对Wx基因序列多态性的分析中,发现一个新的突变位点。位于Wx基因ATG上游1126位置的碱基由A突变为G,导致这些材料的直链淀粉含量上升,由中等直链淀粉含量类型提升为高直链淀粉含量类型。本研究中还分析了淀粉合成相关23个重要基因的表达谱。这23个基因分为5个家族:ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶、颗粒淀粉酶、淀粉分支酶和淀粉脱分支酶。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶主要负责提供糖链延伸的原料:ADP-葡萄糖,在直链、支链淀粉合成中均起作用。颗粒淀粉酶主要参与直链淀粉和长链支链淀粉合成。可溶性淀粉合成酶,淀粉分支酶和淀粉脱分支酶则主要参与支链淀粉合成。这23个基因主要有3种表达模式:在胚乳中特异表达,在光合作用组织中特异表达,在这两类组织中都有表达。在胚乳中表达的基因主要是参与胚乳贮藏型淀粉合成。在光合作用组织中表达的基因主要是将光合作用固定下来的碳源转化为淀粉,保持细胞内渗透压平衡。还发现很多基因在幼穗发育早期表达,主要功能可能是将从光合作用组织中运输过来的碳源转化为临时淀粉,或者是参与雄蕊内淀粉颗粒的合成。在光合作用组织中表达的基因受到光调控,而在胚乳中特异表达的基因对光不敏感。通过扫描电镜观察珍汕97和珍汕97（Wxb）成熟胚乳的细胞精细结构,发现珍汕97（Wxb）胚乳细胞较珍汕97胚乳细胞更容易破裂,但淀粉颗粒却比珍汕97更为紧密。这可能导致珍汕97（Wxb）较难糊化和延伸,从而使得珍汕97（Wxb）较珍汕97有更高的糊化温度和较短的胶稠度。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 精细定位控制水稻抽穗期、株高和每穗颖花数的QTL
• 1 文献综述
• 1.1 控制水稻抽穗期的QTL定位
• 1.1.1 NIPPOBARE/KASALATH衍生群体中控制抽穗期的QTL定位
• 1.1.2 其它组合中控制抽穗期的QTL定位
• 1.2 控制水稻抽穗期的QTL克隆
• 1.3 影响水稻抽穗期的环境因素
• 1.4 控制水稻株高的QTL定位
• 1.5 控制水稻株高的基因克隆
• 1.5.1 水稻矮生基因克隆
• 1.5.2 水稻半矮生基因克隆
• 1.5.3 水稻高秆隐性基因克隆
• 1.6 影响水稻株高理化机制
• 1.6 水稻每穗颖花数QTL定位
• 1.7 水稻产量相关基因精细定位与克隆
• 2 本研究的目的与意义
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.2 田间实验
• 3.3 方法
• 3.3.1 DNA抽提
• 3.3.2 SSR与RFLP分析
• 3.3.3 表型数据考查
• 3.3.4 数据统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 近等基因系珍汕97（GHD7）的遗传背景
• 2F₂-HD1和BC₃F₁的表型'>4.2 明恢63、珍汕97、BC₂F₂-HD1和BC₃F₁的表型
• 2F₂和BC₃F₂目标性状表型分布'>4.3 BC₂F₂和BC₃F₂目标性状表型分布
• 4.4 QTL分析
• 4.6 基因精细定位
• 4.7 日照长短对3个性状的影响
• 5 讨论
• 5.1 GHD7 QTL多效性
• 5.2 GHD7区段重组抑制
• 5.3 GHD7 QTL的应用
• 第二章 图位克隆汕优63中控制胶稠度、糊化温度的基因
• 6 文献综述
• 6.1 淀粉和淀粉颗粒的组成与结构
• 6.2 淀粉的生物合成
• 6.2.1 淀粉合成的前体—蔗糖
• 6.2.2 AGPase催化合成ADP葡萄糖
• 6.2.3 GBSS合成直链淀粉
• 6.2.4 SSS合成支链淀粉
• 6.2.5 淀粉分支酶参与支链淀粉的合成
• 6.2.6 淀粉脱支酶在淀粉合成中的作用
• 6.3 淀粉合成的相关模型
• 6.3.1 支链淀粉合成模型
• 6.3.2 直链淀粉合成模型
• 6.4 影响淀粉合成的环境因素
• 6.4.1 温度对淀粉合成的影响
• 6.4.2 施肥对淀粉合成的影响
• 6.5 淀粉研究的应用
• 6.5.1 抗性淀粉
• 6.5.1.1 抗性淀粉的定义
• 6.5.1.2 抗性淀粉的分类
• 6.5.1.3 抗性淀粉的生理功能
• 6.5.1.4 抗性淀粉含量与直链淀粉含量的关系
• 6.5.2 生物能源
• 6.6 水稻品质相关基因的定位与克隆
• 6.6.1 稻米直链淀粉含量,胶稠度和糊化温度的遗传分析
• 6.6.2 品质相关基因的克隆
• 7 本研究的目的与意义
• 8 材料和方法
• 8.1 材料
• 8.1.1 水稻材料
• 8.1.2 BAC文库
• 8.1.3 载体与菌株
• 8.2 田间实验
• 8.3 方法
• 8.3.1 DNA抽提
• 8.3.2 SSR与RFLP分析
• 8.3.3 直链淀粉含量测定
• 8.3.4 胶稠度测定
• 8.3.5 碱消值（ASV）测定
• 8.3.6 糊化起始温度测定
• 8.3.7 BAC克隆鸟枪法测序（shotgun sequencing）
• 8.3.8 PCR产物测序
• 8.3.9 RNA抽提
• 8.3.10 反转录反应
• 9 结果与分析
• B）携带的外源片段小于4.4CM'>9.1 珍汕97（WX^B）携带的外源片段小于4.4CM
• 9.2 精细定位大群体构建
• 9.3 群体性状考查
• 9.4 AC、GT、GC连锁关系分析
• 9.5 共分离区段遗传距离小于1.1CM
• 9.6 用鸟枪法构建BAC克隆亚克隆库
• 9.7 共分离区段小于14KB
• 9.8 共分离区段基因结构分析
• 9.9 WX基因多态性
• 9.10 ALK基因多态性
• 9.11 WX,ALK基因对性状AC,GT和GC的影响
• 9.12 扫描电镜观察淀粉颗粒结构
• 9.13 淀粉合成酶家族表达谱
• 10 讨论
• 10.1 公共数据信息在本研究中的应用
• 10.2 WX基因的多态性
• 10.3 WX基因对稻米糊化温度的影响
• 10.4 WX和ALK基因对稻米胶稠度影响
• 10.5 淀粉合成相关酶影响胶稠度和糊化温度机理
• 10.6 环境对稻米糊化温度的影响
• 10.7 淀粉合成酶相关基因的表达
• 10.8 直链淀粉含量与胶稠度的研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1:部分试验的详细步骤
• 附录2 个人简历